タンパク質バインダーのデュアル酵素消化とin-situハイドロゲル抽出：芸術作品の信頼性の高い質量分析調査のための鍵

In-situ hydrogel extraction with dual-enzyme digestion of proteinaceous binders: the key for reliable mass spectrometry investigations of artworks.

• Cosima Damiana Calvano
• Elena C L Rigante
• Tommaso R I Cataldi
• Luigia Sabbatini

抄録

塗料層のプロテイナーセウス性バインダーのin-situデュアル酵素消化に基づく新しい戦略は、より迅速かつ確実な同定のために導入され、MALDI-TOF質量分析(MS)によるボトムアッププロテオミクスアプローチにつながっています。以前にトリプシンとキモトリプシンタンパク分解酵素でロードされた親水性ゲルの小片を使用してタンパク質含有バインダーのin-situサンプリング/抽出は、成功裏に利用されました。最小限の侵襲性とともに、両方の酵素の相乗効果は、データベース検索とそれに続くMALDI-TOF/TOF分析によって、対応するアミノ酸配列とアノテーションされたペプチドピークの数を増加させるために非常に有用であった。プロトコルは、最初に卵ベースの結合剤の識別を強化することを目的としていたし、新鮮で熟成されたモデルの絵層上で検証され、増加したタンパク質のカバレッジは、使用されている塗装結合剤に関係なく、有意に達成された。光学顕微鏡画像と分光光度法による分析では、ハイドロゲルの残留物を残すことなく、接触/サンプリングのために塗装層が損傷したり、変更されていないことが証明されました。提案されたプロトコルは、成功した16世紀に描かれた祭壇画"聖母被昇天"と、両方のAltamuraの大聖堂（アプリア、イタリア）からの12世紀の聖誕祭のクリブの天使像に適用されました。動物由来の様々なタンパク質結合体の発生は、簡単かつ確実に確認されました。

A novel strategy based on in-situ dual-enzyme digestion of paint layers proteinaceous binders is introduced for faster and more confident identification, ensuing a bottom-up proteomics approach by MALDI-TOF mass spectrometry (MS). In-situ sampling/extraction of proteinaceous binders using small pieces of a hydrophilic gel, previously loaded with trypsin and chymotrypsin proteolytic enzymes, was successfully exploited. Along with minimal invasiveness, the synergy of both enzymes was very useful to increase the number of annotated peptide peaks with their corresponding amino acid sequence by database search and subsequent MALDI-TOF/TOF analysis. The protocol was initially aimed at enhancing the identification of egg-based binders and then validated on fresh and aged model pictorial layers; an increased protein coverage was significantly attained regardless of the used painting binders. Optical microscope images and spectrophotocolorimetry analysis evidenced that the painting layers were not damaged or altered because of contact/sampling without leaving hydrogel residues. The proposed protocol was successfully applied on a painted altarpiece "Assumption of the Virgin" dated XVI century and on an angel statue of the Nativity crib dated XII century, both from the Altamura's Cathedral (Apulia, Italy). The occurrence of various protein binders of animal origin was easily and reliably ascertained.