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下痢性および接触性の牛および水牛の子牛から分離された病原性大腸菌の分子的特徴付け
Molecular characterization of pathogenic Escherichia coli isolated from diarrheic and in-contact cattle and buffalo calves.
PMID: 32647966 PMCID: PMC7347405. DOI: 10.1007/s11250-020-02343-1.
抄録
子牛から分離された病原性大腸菌を、異なる特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を用いて特徴付けし、最も重要な下痢原性のパスタイプに分類した。使用したPCRシステムは、fimbriae f5（K99）、滋賀毒素（stxおよびstx）、熱安定性腸毒素（st）、熱溶性腸毒素（lt）、intimin（eae）、ヘモリシン（hylA）、およびEAEC熱安定性腸毒素（astA）をコードする群特異的病原性遺伝子を表す配列を検出するように設計されていた。本研究では，生後3ヶ月未満の接触牛および水牛の子牛から採取した150検体の糞便スワブから合計150株の大腸菌を分離した．これら150株のうち，下痢症77株，非接触子牛29株から106株が調査対象の病原性遺伝子を1つ以上保有していた．分離された病原性大腸菌は，それぞれ30.7株，2.7株，12.7株，7.3％の分布で，シガトキシン性大腸菌（STEC），腸原性大腸菌（EPEC），腸炎性大腸菌（ETEC），腸管凝集性大腸菌（EAEC）に分類された．一方、f5、stx、stx、st、lt、eae、hylA、および astA遺伝子の検出率は、それぞれ17.3、27.3、6.7、10、37.3、17.7、9.3、および20.7％であった。これらの病原性遺伝子は、stx/eae, stx/st/f5, eae/st/f5, st/lt/f5のように、単独または異なる組み合わせで検出された。 また、stx/eaeを保有する4つの attaching-effacing shigatoxenic E. coli分離株（AE-STEC）を下痢性の子牛から回収した。stx/eae陽性の分離株はいずれもO157:H7であることが確認されなかったが、一見健康な子牛から検出されたSTECはヒトへの病原性を有する可能性があり、人獣共通感染症のリザーバーとしての重要性が強調された。また、ETEC/STECとETEC/EPECの非典型的な組み合わせも、それぞれ14.7％と2.7％の割合で検出された。これらの非典型的な組み合わせのほとんどは、牛の子牛よりも水牛の子牛で多く検出された。STECとEPECの分離株は水牛の子牛よりも牛の子牛で多く検出されたが、ETECの分離株は2つの種で同じであった。子牛の病原性大腸菌感染は生後数週間で高くなり、生後 4 週間で病原性因子陽性株が最も多く検出された。死亡した4頭の子牛から採取した5頭の腸管サンプルの病理組織学的検査では、典型的な付着・排出（AE）病変が認められ、これは病原性遺伝子（eae）をコードするintiminの存在と相関していた。また，出血性腸炎，腸絨毛の短縮・融合，腸管粘膜の粘膜上皮の脱落を特徴とする病変も検出された．
Escherichia coli field isolates from calves were characterized and categorized into the most significant diarrheagenic pathotypes using polymerase chain reaction (PCR) assays with different specific primers. The used PCR systems were designed to detect sequences representing the group-specific virulence genes encoding fimbriae f5 (K99), Shiga toxins (stx and stx), heat-stable enterotoxins (st), heat-labile enterotoxins (lt), intimin (eae), hemolysin (hylA), and EAEC heat-stable enterotoxin (astA). In the present work, a total of 150 E. coli field isolates were recovered from 150 fecal swabs collected from 100 diarrheic and 50 apparently healthy in-contact cattle and buffalo calves under 3 months old. Out of these 150 isolated E. coli, 106 isolates from 77 diarrheic and 29 in-contact calves harbored one or more of the investigated virulence genes. The pathotyping of the isolates could classify them into shigatoxigenic E. coli (STEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), and enteroaggregative E. coli (EAEC) with a 30.7, 2.7, 12.7, and 7.3% distribution, respectively. Meanwhile, the detection rates of f5, stx, stx, st, lt, eae, hylA, and astA genes were 17.3, 27.3, 6.7, 10, 37.3, 17.7, 9.3, and 20.7%, respectively. These virulence genes were found either single or in different combinations, such as stx/eae, stx/st/f5, eae/st/f5, or st/lt/f5. Four attaching-effacing shigatoxigenic E. coli isolates (AE-STEC) harboring stx/eae were retrieved from diarrheic calves. Although none of the stx-or eae-positive isolates was verified as O157:H7, STEC isolates detected in apparently healthy calves have potential pathogenicity to humans highlighting their zoonotic importance as reservoirs. Atypical combinations of ETEC/STEC and ETEC/EPEC were also detected in percentages of 14.7 and 2.7%, respectively. Most of these atypical combinations were found more in buffalo calves than in cattle calves. While STEC and EPEC isolates were detected more in cattle calves than in buffalo calves, ETEC isolates were the same in the two species. The pathogenic E. coli infection in calves was recorded to be higher in the first weeks of life with the largest numbers of virulence factor-positive isolates detected at the age of 4 weeks. Histopathological examination of five intestinal samples collected from four dead buffalo calves revealed typical attaching and effacing (AE) lesion which was correlated with the presence of intimin encoding virulence gene (eae). Other lesions characterized by hemorrhagic enteritis, shortening and fusion of intestinal villi and desquamation of the lining epithelium of intestinal mucosa had also been detected.