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多重マイクロ流体ループ媒介等温増幅法と視覚的検出法による30種類の皮膚ヒトパピローマウイルスの遺伝子型解析を行った
Genotyping of 30 kinds of cutaneous human papillomaviruses by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification and visual detection method.
PMID: 32646520 PMCID: PMC7345449. DOI: 10.1186/s12985-020-01373-3.
抄録
背景:
ヒトパピローマウイルス（HPV）は、良性イボなどの複数の皮膚疾患の原因となる二本鎖の円形DNAを持つ非発生型の小型ウイルスであり、診療所でよく見られるウイルスです。現在のHPV検出システムは主に粘膜HPVを対象としていますが、皮膚HPV検出のための効率的な臨床的アプローチは不足しています。
BACKGROUND: Human papillomaviruses (HPVs), a group of non-enveloped small viruses with double-stranded circular DNA which lead to multiple skin diseases such as benign warts, are commonly seen in clinics. The current HPV detection systems aim mainly at mucosal HPVs, however, an efficient clinical approach for cutaneous HPVs detection is lacking.
目的:
ヒドロキシナフトールブルー（HNB）色素を用いた比色ループ媒介等温増幅（LAMP）とマイクロ流体技術を組み合わせた皮膚HPVの迅速検出システムを確立する。
OBJECTIVES: To establish a rapid detection system for cutaneous HPVs using a colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP) with hydroxynaphthol blue (HNB) dye in combination with microfluidic technology.
方法:
30種の皮膚型HPVのL1 DNA配列を化学合成し、オンラインLAMP設計ツールを用いてL1 DNAに対するLAMPプライマーを設計した。水浴を用いて等温増幅を行い，増幅結果を肉眼で確認した．PCRシークエンシングを対照法として、臨床サンプルを検出し、本検出システムの特異性と感度を確認した。
METHODS: L1 DNA sequences of the 30 cutaneous HPVs were chemically synthesized, and LAMP primers against L1 DNA were designed with use of an online LAMP designing tool. Isothermal amplification was performed with use of a water bath and the amplification results were inspected with the naked eye. Using PCR sequencing as a control method, the specificity and sensitivity of the new detection system were obtained by detecting clinical samples.
結果:
LAMPアッセイの検出下限は、合成されたL1 DNA配列で試験した場合、10ウイルスDNAコピー/μlであり、従来のPCRよりも良好であった。PCR法と比較して，HPV27，HPV2，HPV1，HPV57，HPV3，HPV4，HPV7およびHPV75遺伝子型の検出感度は100％であったが，特異度はそれぞれ34.55，45.12，95.83，98.59および97.62％であった．
RESULTS: The lower detection limit of the LAMP assay was 10 viral DNA copies/μl when tested on synthesized L1 DNA sequences, which was better than the conventional PCR. Compared to PCR sequencing, the sensitivity of HPV27, HPV2, HPV1, HPV57, HPV3, HPV4, HPV7 and HPV75 genotypes detections were 100%, whereas the specificity was 34.55, 45.12, 95.83, 98.59 and 97.62% respectively, when tested on clinical samples.
結論:
新しい皮膚型HPV検出システムは、従来法と比較して感度と特異度が良好であることを特徴としている。
CONCLUSIONS: The new cutaneous type HPV detection system is characterized by both a good sensitivity and specificity compared to conventional methods.