Dna2エンドヌクレアーゼ/ヘリカーゼの二次構造DNA結合活性は、複製ストレス下での細胞増殖に重要な役割を果たしている

The secondary-structured DNA-binding activity of Dna2 endonuclease/helicase is critical to cell growth under replication stress.

• Soyeong Park
• Nargis Karatayeva
• Annie Albert Demin
• Palinda Ruvan Munashingha
• Yeon-Soo Seo

抄録

Dna2は、N末端にコードされたDNA結合活性とC末端にコードされたエンドヌクレアーゼ/ヘリカーゼ活性の3つの生化学的活性が協調して作用することで、DNAの二次構造を含む5'フラップを効率的に処理することができる。本研究では、この3つの機能ドメイン間のクロストークを、様々なDNA2変異体とその由来の酵素を用いて調べた。その結果、Dna2の触媒活性を阻害すると、N末端ドメインに存在するDna2依存性チェックポイントが活性化されることを見出した。このチェックポイント活性は、Dna2触媒変異体の成長障害に寄与しており、Dna2の分子内機能クロストークの存在を明らかにした。Dna2のN末端ドメインは、ホリデイジャンクションなどのDNA複製フォーク中間体を模倣した基質に特異的に結合していた。Dna2のN末端ドメインの部位特異的変異誘発を用いて、5つの連続した塩基性アミノ酸残基がDna2がin vitroでヘアピンDNAを結合する能力に不可欠であることを発見した。アラニンで置換された5つの塩基性アミノ酸残基をすべて含むDna2対立遺伝子を発現する変異体細胞は、3つの異なる表現型を示した。(i) 温度に敏感な成長欠損、(ii) S 相停止のバイパス、(iii) DNA 損傷剤に対する感受性の増加である。これらの結果から、Dna2 の N 末端調節ドメインと C 末端触媒ドメインの相互作用が、生体内で重要な役割を果たしていること、特に細胞が複製ストレス下に置かれた場合に重要な役割を果たしていることが示唆された。

Dna2 can efficiently process 5' flaps containing DNA secondary structure using coordinated action of the three biochemical activities; the N-terminally encoded DNA-binding activity and the C-terminally encoded endonuclease and helicase activities. In this study, we investigated the crosstalk among the three functional domains using a variety of dna2 mutant alleles and enzymes derived thereof. We found that disruption of the catalytic activities of Dna2 activated Dna2-dependent checkpoint, residing in the N-terminal domain. This checkpoint activity contributed to growth defects of dna2 catalytic mutants, revealing the presence of an intramolecular functional crosstalk in Dna2. The N-terminal domain of Dna2 bound specifically to substrates that mimic DNA replication fork intermediates, including Holliday junctions. Using site-directed mutagenesis of the N-terminal domain of Dna2, we discovered that five consecutive basic amino acid residues were essential for the ability of Dna2 to bind hairpin DNA in vitro. Mutant cells expressing the dna2 allele containing all five basic residues substituted with alanine displayed three distinct phenotypes: (i) temperature-sensitive growth defects, (ii) bypass of S phase arrest, and (iii) increased sensitivity to DNA-damaging agents. Taken together, our results indicate that the interplay between the N-terminal regulatory and C-terminal catalytic domains of Dna2 plays an important role in vivo, especially when cells are placed under replication stress.

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