低アバンダンスのホスホペプチドを選択的に濃縮するための新規MOACアフィニティープローブのin-situ合成

In-situ synthesis of a novel MOAC affinity probe for the selective enrichment of low-abundance phosphopeptides.

• Baichun Wang
• Huanming Wu
• Yinghua Yan
• Keqi Tang
• Chuan-Fan Ding

抄録

ラショナル:

リン酸化状態の動的な性質やリン酸化ペプチドの化学量論が低いため、質量分析分析の前に複雑な生物学的サンプルからリン酸化ペプチドを効率的に捕捉することは、未だに課題となっています。濃縮戦略の中でも、金属酸化物アフィニティークロマトグラフィー（MOAC）は、最も広く使用されており、最も可能性のあるものの一つです。これは、金属酸化物と負に帯電したリン酸基との間の可逆的なルイス酸塩基相互作用に基づいており、ホスホペプチドの特異的な選択を実現します。

RATIONALE: Due to the dynamic nature of phosphorylation states and the low stoichiometry of phosphopeptides, it is still a challenge for us to efficiently capture phosphopeptides from complex biological samples before mass spectrometry analysis. Among the enrichment strategies, metal oxide affinity chromatography (MOAC) is one of the most widely used and with the most potential. It is based on reversible Lewis acid-base interactions between the metal oxides and the negatively charged phosphate groups to achieve the specific selection of phosphopeptides.

方法:

ポリドーパミン(PDA)で修飾したグラフェン(G)表面にZrOをin-situグラフトすることにより、新規MOACプローブ(G@PDA@ZrO)を合成することに成功した。このようにして得られた新規MOACプローブは、ホスホペプチドの濃縮に使用された。

METHODS: A novel MOAC affinity probe, denoted as G@PDA@ZrO , was successfully synthesized by in-situ grafting ZrO onto the surface of the graphene (G) modified with polydopamine (PDA). The novel MOAC probe thus obtained was used for phosphopeptide enrichment.

結果:

この新規MOACアフィニティープローブを用いて、標準的なタンパク質消化液からホスホペプチドを選択的に濃縮したところ、高い選択性（β-カゼイン：ウシ血清アルブミン＝1：1000）、低い検出限界（4fmol）、高い負荷容量（400mg/g）を示しました。同時に、実験の結果、G@PDA@ZrOはリサイクル性（5サイクル）、安定性、再現性に優れていることが証明されました。その後、G@PDA@ZrOをヒト唾液および血清中のリン酸ペプチドの濃縮に適用したところ、それぞれ25個および4個のリン酸ペプチドのピークが検出されました。

RESULTS: When this novel MOAC affinity probe was used to selectively enrich phosphopeptides from standard protein digest solutions, it exhibited a high selectivity (β-casein:bovine serum albumin = 1:1000), a low detection limit (4 fmol), and a high loading capacity (400 mg/g). At the same time, the experiment results proved that G@PDA@ZrO had great recyclability (five cycles), stability, and reproducibility. Subsequently, G@PDA@ZrO was applied to enrich phosphopeptides from human saliva and human serum, in which 25 and 4 phosphopeptide peaks, respectively, were detected.

結論:

金属酸化物を担体表面にin-situグラフトすることにより作製したこの新しいMOACアフィニティープローブ(G@PDA@ZrO)は、ホスホペプチドの濃縮に優れた性能を示しました。このことから、G@PDA@ZrOはホスホペプチドミクス解析に適していると考えられます。

CONCLUSIONS: This novel MOAC affinity probe (G@PDA@ZrO ), prepared by in-situ grafting metal oxides onto the surface of the carrier, showed good performance in enriching phosphopeptides. Thus, G@PDA@ZrO has good potential in phosphopeptidomics analysis.

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