インドネシアの国立人工授精センターでホルスタイン牛の繁殖力を示す精子タンパク質マーカーを測定

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Vet World.2020 May;13(5):947-955. Vetworld-13-947. doi: 10.14202/vetworld.2020.947-955.Epub 2020-05-20.

インドネシアの国立人工授精センターでホルスタイン牛の繁殖力を示す精子タンパク質マーカーを測定

Sperm protein markers for Holstein bull fertility at National Artificial Insemination Centers in Indonesia.

Zulfi Nur Amrina Rosyada
Mokhamad Fakhrul Ulum
Ligaya I T A Tumbelaka
Bambang Purwantara

PMID: 32636592 PMCID: PMC7311869. DOI: 10.14202/vetworld.2020.947-955.

抄録

背景と狙い:

インドネシアでは、人口増加と乳量増加のために人工授精（AI）によってホルスタイン牛や未経産牛が広く繁殖されています。精子の受胎率は遺伝的要因によって調節されているが、精子の質の分析は未だにマクロ的・ミクロ的な特性に基づいている。本研究では、異なる受胎率レベルのホルスタイン雄牛の精子の質とタンパク質の両方を分析することを目的とした。

Background and Aim: Holstein cows and heifers are widely bred in Indonesia by artificial insemination (AI) to increase population and milk production. Sperm fertility is modulated by genetic factors, but the analysis of sperm quality is still based on macro- and microscopic characteristics. This study aimed to analyze both sperm quality and proteins of Holstein bulls at different fertility levels.

材料と方法:

凍結精液サンプルはインドネシア国立人工知能センターから収集した。凍結精液サンプルは、生殖効率データに基づいて、高受胎率（HF）と低受胎率（LF）に分類された。精子の質は顕微鏡で評価した。ホルスタイン精子の蛋白質は、プロテアーゼ阻害剤としてフェニルメタンスルホニルフルオライドを用い、ベンジジン洗浄剤抽出法で抽出した。不連続ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）を行い、精子蛋白質の分子量（ＭＷ）を分析した。得られたデータを一因子ブル繁殖度を用いたt検定で分析し、スピアマンの相関分析を用いて、精子の顕微鏡的評価パラメータとタンパク質バンドとの相関関係を明らかにした。

Materials and Methods: The frozen semen samples were collected from the Indonesia National AI Center. They were classified based on the reproductive efficiency data and were grouped into high fertile (HF) and low fertile (LF). Sperm qualities were evaluated by microscopic evaluation. The Holstein sperm proteins were extracted using phenylmethanesulfonyl fluoride as a protease inhibitor and the benzidine detergent extraction method. Discontinuous sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) was conducted to analyze the molecular weights (MWs) of the sperm proteins. The data obtained were analyzed by a t-test using the one-factor bull fertility level, and Spearman's correlation analysis was used to identify the correlation between the sperm microscopic evaluation parameters and protein bands.

結果:

凍結融解後の精子の運動性は、HFとLFで有意差はなかった（p>0.05）。HFレベルでは、LFレベルよりも生存率、無傷の形質膜完全性、無傷のアクロソームの割合が高かった(p<0.05)。濃度の異なるホルスタイン雄牛の精子タンパク質のSDS-PAGEでは、5つのタンパク質バンドが検出された。その結果、HFレベルのホルスタイン牛では17.51 kDa, 14.87 kDa, 33.71 kDa, 41.97 kDaのMWを持つタンパク質が多く、LFレベルのホルスタイン牛では55 kDaのタンパク質が多く含まれていた。HFレベルのホルスタイン雄牛の精子には、LFレベルでは検出されなかった約33.71 kDaのタンパク質が含まれていた。

Results: The sperm motility post-freeze thawing was not significantly different between the HF and LF (p>0.05). The HF level had a higher percentage of viability, intact plasma membrane integrity, and intact acrosomes than the LF (p<0.05). Five protein bands were found in the SDS-PAGE of sperm proteins of Holstein bulls with different concentrations. Sperm proteins with MWs of 17.51 kDa, 14.87 kDa, 33.71 kDa, and 41.97 kDa were abundant in the Holstein bulls with an HF level, while 55 kDa proteins were abundant in the LF level of Holstein bulls. The sperm of Holstein bulls in the HF level contained proteins of about 33.71 kDa that were not detected in the LF.

結論:

その結果、分子量33.71 kDaの精子蛋白質が雄牛の受胎能力に影響を与える特異的な蛋白質バイオマーカーであることが予測された。また、精子の受精能力は、精子タンパク質、精子アクロソームの形態、漿膜の質によっても決定された。この方法は、ホルスタイン牛の個体数を増やすために、繁殖力の高い雄牛を選抜するために利用することができる。

Conclusion: The sperm protein with a molecular weight of 33.71 kDa was predicted to be a specific protein biomarker that influences bull fertility. Sperm fertilization abilities were also determined by the sperm proteins, the morphology of sperm acrosomes, and the quality of plasma membranes. This method can be used to select bulls with high fertility to increase the population of Holstein bulls.