尾部固定蛋白質チトクロム-Bを用いた小胞体の赤色蛍光マーカーを持つシロイヌナズナ系統の作製

Generation of Arabidopsis lines with a red fluorescent marker for endoplasmic reticulum using a tail-anchored protein cytochrome -B.

• Minoru Nagano
• Haruko Ueda
• Yoichiro Fukao
• Maki Kawai-Yamada
• Ikuko Hara-Nishimura

抄録

小胞体（ER）は真核生物において複数の細胞活動を行う多機能オルガネラである。蛍光タンパク質を用いて小胞体を可視化することは、小胞体の動態を解析し、その機能を理解するための強力な方法である。しかし、N末端にシグナルペプチド（SP）とC末端にER保持テトラペプチド（HDEL）を持つ赤色蛍光タンパク質は、シロイヌナズナで構成的に発現した場合、液胞や細胞外空間に局在化してしまうことが多い。そこで、シロイヌナズナのシトクロム-B (Cb5-B)を選択し、赤色蛍光性のERマーカーを取得した。Cb5-Bは、C末端の膜貫通ドメイン（TMD）と尾部ドメインによって局在が決定される。Cb5-Bの膜貫通ドメインと尾部ドメインを赤色蛍光タンパク質tdTomato（tdTomato-CTT）のC末端に融合させた。tdTomato-CTTをシロイヌナズナでユビキチン10プロモーター下に発現させたところ、蛍光シグナルは信頼性の高いERマーカーSP-GFP-HDELによりERでのみ検出された。したがって、tdTomato-CTTは安定なシロイヌナズナ系統の小胞体を正確に可視化することが可能である。また、一過性のアッセイにより、tdTomato-CTT はタマネギ、イネ、シロイヌナズナの ER マーカーとしても利用できることが示された。我々は、TAタンパク質は植物の様々な細胞膜マーカーの生成に利用できると考えている。

The endoplasmic reticulum (ER) is a multifunctional organelle that performs multiple cellular activities in eukaryotes. Visualizing ER using fluorescent proteins is a powerful method of analyzing its dynamics and to understand its functions. However, red fluorescent proteins with both an N-terminal signal peptide (SP) and a C-terminal ER retention tetrapeptide (HDEL) often cause mislocalization to vacuoles or extracellular spaces when they are constitutively expressed in Arabidopsis. To obtain a red fluorescent ER marker, we selected Arabidopsis cytochrome -B (Cb5-B), a tail-anchored (TA) protein on the ER membrane. Its localization is determined by the transmembrane domain (TMD) and tail domain at the C-terminus. We fused the TMD and the tail domain of Cb5-B to the C-terminus of a red fluorescent protein, tdTomato (tdTomato-CTT). When tdTomato-CTT was constitutively expressed under the ubiquitin10 promoter in Arabidopsis, the fluorescent signal was exclusively detected at the ER by means of the reliable ER marker SP-GFP-HDEL. Therefore, tdTomato-CTT can accurately visualize the ER in stable Arabidopsis lines. Additionally, transient assays showed that tdTomato-CTT can also be used as an ER marker in onion, rice, and . We believe that TA proteins could be used to generate various organellar membrane markers in plants.