本研究では、比色スクリーニング法を用いて分離された土壌中のDNRA細菌の生理的特徴を明らかにし、DNRA活性の生態生理学的制御にNOが関与していることを示唆した

Physiological characterization of soil DNRA bacteria isolated via a colorimetric screening method implies involvement of NO in ecophysiological regulation of DNRA activity.

• Hokwan Heo
• Miye Kwon
• Bongkeun Song
• Sukhwan Yoon

抄録

硝酸塩/亜硝酸塩をアンモニウムに還元するDNRA（Dissimilatory Nitrate/Nitrite Reduction to ammonium）は、脱窒による窒素損失を軽減するための窒素保持経路として近年注目されている。これまで、農耕地土壌に生息するDNRA菌の生態生理については、対象とするDNRA微生物の濃縮や単離が困難であることから、ほとんど解明されていませんでした。本研究では、新たに開発した比色スクリーニング法を用いて、水田土壌に設置したNO還元性無酸素濃縮培養物から100種類以上のDNRA菌を分離した。そのうち6株は、DNRAの生理機能の理解を深めるために、それぞれ異なる属に分類されており、その特徴を明らかにした。その結果、すべての分離株は、NO還元能を有するクラッドII遺伝子を保有していた。DNRA3とDNRA5を保有するsp. DNRA3では、NH産生前にNOが蓄積されることが共通して観察された。また、両分離株ともサブミリモル濃度ではNOからNHへの還元が阻害され、NOからNOへの還元時には転写が抑制されていた。バッチ実験およびケモスタット実験では、両分離株とも過剰な有機電子供与体を添加した場合にはNO還元からNHが生成されたが、過剰なNOを添加した場合にはNOの蓄積は見られたが、実質的なNH生成は見られなかった。これまで見落とされていたNOによるNO-NH還元の抑制とDNRA活性のC-N比制御との関連は、土壌における脱窒とDNRAの競争を支える重要なメカニズムである可能性がある。硝酸塩/亜硝酸塩のアンモニウムへの還元反応（DNRA）は、嫌気性微生物の経路であり、共通の基質である NO と NO のために脱窒と競合する。したがって、DNRAの刺激は、しばしば肥料の効率を向上させ、温室効果ガスの排出量を削減するための戦略として提案されている。このような試みは、土壌のDNRA細菌の生態生理への洞察の欠如によって妨げられてきた。ここで、我々は、明らかなDNRA活性を持たない農業用土壌からDNRA触媒生物を分離するための新しいスクリーニング方法を開発した。その結果、これまで見落とされていたNO-to-NH還元のNOリプレッションとDNRA活性のC-to-N比制御との関連性が明らかになった。

Dissimilatory nitrate/nitrite reduction to ammonium (DNRA) has recently regained attention as a nitrogen retention pathway that may potentially be harnessed to alleviate nitrogen loss resulting from denitrification. Until recently, ecophysiology of DNRA bacteria inhabiting agricultural soils has remained largely unexplored, due to the difficulty in targeted enrichment and isolation of DNRA microorganisms. In this study, >100 DNRA bacteria have been isolated from NO-reducing anoxic enrichment cultures established with rice paddy soils using newly developed colorimetric screening method. Six of these isolates, each assigned to a different genus, were characterized to improve understanding of DNRA physiology. All the isolates carried and/or , and sp. possessed a clade II gene with capability of NO reduction. A common prominent physiological feature observed in the isolates was NO accumulation before NH production, which was further examined with sp. DNRA3 (possessing and ) and sp. DNRA5 (possessing only ). Both isolates showed inhibition of NO-to-NH reduction at submillimolar NO concentrations, and down-regulation of or transcription when NO was being reduced to NO In batch and chemostat experiments, both isolates produced NH from NO reduction when incubated with excess organic electron donors, while the incubation with excess NO resulted in NO buildup but no substantial NH production, presumably due to inhibitory NO concentrations. This previously overlooked link between NO repression of NO-to-NH reduction and the C-to-N ratio regulation of DNRA activity may be a key mechanism underpinning denitrification-vs-DNRA competition in soil. Dissimilatory nitrate/nitrite reduction to ammonium (DNRA) is an anaerobic microbial pathway that competes with denitrification for common substrates NO and NO Unlike denitrification leading to nitrogen loss and NO emission, DNRA reduces NO and NO to NH, a reactive nitrogen with higher tendency to be retained in soil matrix. Therefore, stimulation of DNRA has often been proposed as a strategy to improve fertilizer efficiency and reduce greenhouse gas emissions. Such attempts have been hampered by lack of insights into soil DNRA bacterial ecophysiology. Here, we have developed a new screening method for isolating DNRA-catalyzing organisms from agricultural soils without apparent DNRA activity. Physiological characteristics of six DNRA isolates were closely examined, disclosing a previously overlooked link between NO repression of NO-to-NH reduction and the C-to-N ratio regulation of DNRA activity, which may be a key to understanding why DNRA activity is rarely observed at substantial levels in nitrogen-rich agricultural soils.

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