動的核偏光NMRとフローサイトメトリーによる内因性HIV活性化のその場検出

In Situ Detection of Endogenous HIV Activation by Dynamic Nuclear Polarization NMR and Flow Cytometry.

• Sarah A Overall
• Lauren E Price
• Brice J Albert
• Chukun Gao
• Nicholas Alaniva
• Patrick T Judge
• Erika L Sesti
• Paul A Wender
• George B Kyei
• Alexander B Barnes

抄録

我々は、細胞内サンプルの細胞の不均一性に対処するために、フローサイトメトリーソーティングと組み合わせた細胞内動的核分極（DNP）を初めて実証した。HIV再活性化の緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターを用いて、HIV潜伏期のヒト細胞株モデルにおいて、N共鳴強度の増加とサイトカイン主導のHIV再活性化との間に相関があることを明らかにした。DNP核磁気共鳴（NMR）により、わずか10％のGFP+細胞が検出された。DNP-NMRによる分析に先立ち、GFP+細胞のフローサイトメトリーソーティングを含めることで、GFP発現に関して細胞の均質性が向上し、シグナル検出率がさらに向上した。DNP-NMRでは、わずか360万個のN標識GFP+細胞を容易に検出することができました。重要なことは、細胞ソーティングにより、サイトカイン処理したGFP+細胞とGFP-細胞の比較がバッチ一貫した方法で可能になったことである。これは、細胞モジュレーターで処理した後のバックグラウンド細胞プロセスからのNMRスペクトル寄与を正規化する手段を提供する。我々はまた、Jurkat T細胞におけるAMUPol（ニトロキシドビラジカル）の顕著な安定性を実証し、10 mMのAMUPolで46の細胞内増強を達成し、さらなる細胞内DNP-NMR研究のための優れたモデルシステムを提供しています。これは、DNP-NMRによる内因性発現タンパク質の研究のための細胞内方法の改善に重要な貢献を表しています。

We demonstrate for the first time in-cell dynamic nuclear polarization (DNP) in conjunction with flow cytometry sorting to address the cellular heterogeneity of in-cell samples. Utilizing a green fluorescent protein (GFP) reporter of HIV reactivation, we correlate increased N resonance intensity with cytokine-driven HIV reactivation in a human cell line model of HIV latency. As few as 10% GFP+ cells could be detected by DNP nuclear magnetic resonance (NMR). The inclusion of flow cytometric sorting of GFP+ cells prior to analysis by DNP-NMR further boosted signal detection through increased cellular homogeneity with respect to GFP expression. As few as 3.6 million N-labeled GFP+ cells could be readily detected with DNP-NMR. Importantly, cell sorting allowed for the comparison of cytokine-treated GFP+ and GFP- cells in a batch-consistent way. This provides an avenue for normalizing NMR spectral contributions from background cellular processes following treatment with cellular modulators. We also demonstrate the remarkable stability of AMUPol (a nitroxide biradical) in Jurkat T cells and achieved in-cell enhancements of 46 with 10 mM AMUPol, providing an excellent model system for further in-cell DNP-NMR studies. This represents an important contribution to improving in-cell methods for the study of endogenously expressed proteins by DNP-NMR.