肝臓の再生を遅らせることでCCl_4によって誘導される肝毒性を悪化させるプソラレンのメカニズム

[Mechanism of psoralen in aggravating hepatotoxicity induced by CCl_4 by delaying liver regeneration].

• Pei-Shi Liang
• Wang Zhou
• Zhen-Zhou Jiang
• Lu-Yong Zhang

抄録

本研究の目的は、四塩化炭素(CCl_4)による肝毒性を、psoralenが肝細胞周期停止を誘導し、肝再生を遅延させることで悪化させるかどうかを調べることである。6～8週齢の雌C57 BL/6マウスを対照群、モデル群(CCl_4群)、複合群(CCl_4+PSO群)、psoralen群(PSO群)に無作為に分けた。CCl_4群及びCCl_4+PSO群には、CCl_4を100μL-kg~(-1)の用量で1回腹腔内投与した；コントロール群及びPSO群には、同量のオリーブオイルを腹腔内投与した；CCl_4注射後12時間、36時間及び60時間後に、PSO群及びCCl_4+PSO群には、PSOを200mg-kg~(-1)の用量で胃内投与した；0．コントロール群とPSO群に同量の5% CMC-Naを胃内投与した。マウスの体重は毎日記録した。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)をCCl_4注射後36時間後、60時間後、84時間後に測定した。最後の血清サンプルを採取した後、マウスを犠牲にした。肝臓サンプルを採取し、肝臓重量を記録した。肝臓の病理組織学的および形態学的変化を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色により観察した。肝臓におけるＨＧＦ、ＴＧＦ-β、ＴＮＦ-α、ｐ５３およびｐ２１のｍＲＮＡレベルをＲＴ-ｑＰＣＲにより検出した。また、細胞周期関連タンパク質の検出にはウエスタンブロットを用いた。その結果、CCl_4+PSO投与群では、血清ALTとASTの有意な上昇と、大量の炎症性細胞浸潤を伴う遠心球壊死が観察されました。CCl_4モデルでPSO投与後、HGF(肝細胞増殖因子)とTNF-αのmRNAレベルが低下し、TGF-β、p53、p21のmRNA発現が上昇した。PCNA(増殖細胞核抗原)の発現は、CCl_4群とCCl_4+PSO群で有意に増加し、CCl_4+PSO群の相対的な蛋白質レベルはCCl_4群よりもわずかに低かった。また、対照群やCCl_4群と比較して、CCl_4+PSO群ではp27(cyclic dependent kinase inhibitor protein p27)の発現が顕著に増加していました。これらの結果から、CCl_4で誘発された肝毒性はPSOを腹腔内投与することで悪化し、肝臓の修復過程が遅れる可能性があることが示唆されました。このことから、PSOによるPCNAの阻害と細胞周期関連蛋白質の調節が関係している可能性が示唆され、その際にはp27、p53、p21の有意なアップレギュレーションが重要な役割を果たしている可能性が示唆されました。

This study aimed to investigate whether psoralen can aggravate hepatotoxicity induced by carbon tetrachloride(CCl_4) by inducing hepatocyte cycle arrest and delaying liver regeneration. Female C57 BL/6 mice aged 6-8 weeks were randomly divided into control group, model group(CCl_4 group), combined group(CCl_4+PSO group) and psoralen group(PSO group). CCl_4 group and CCl_4+PSO group were given CCl_4 intraperitoneally at a dose of 100 μL·kg~(-1) once; olive oil of the same volume was given to control group and PSO group intraperitoneally; 12 h, 36 h and 60 h after CCl_4 injection, PSO group and CCl_4+PSO group were administrated with PSO intragastrically at a dose of 200 mg·kg~(-1); 0.5% CMC-Na of the same volume was administrated to control group and PSO group intragastrically. The weight of mice was recorded every day. Serum alanine aminotransferase(ALT) and aspartate aminotransferase(AST) were measured at 36 h, 60 h and 84 h after CCl_4 injection. Mice were sacrificed after collection of the last serum samples. Liver samples were collected, and liver weight was recorded. Histopathological and morphological changes of liver were observed by haematoxylin and eosin staining. The mRNA levels of HGF, TGF-β, TNF-α, p53 and p21 in liver were detected by RT-qPCR. Western blot was used to detect the levels of cell cycle-related proteins. According to the results, significant increase of serum ALT and AST and centrilobular necrosis with massive inflammatory cell infiltration were observed in CCl_4+PSO group. After PSO administration in CCl_4 model, the mRNA levels of HGF(hepatocyte growth factor) and TNF-α were reduced, while the mRNA expressions of TGF-β, p53 and p21 was up-regulated. The expression of PCNA(proliferating cell nuclear antigen) was significantly increased in CCl_4 and CCl_4+PSO group, while the relative protein level in CCl_4+PSO group was slightly lower than that in CCl_4 group. Compared with control and CCl_4 group, the expression of p27(cyclic dependent kinase inhibitor protein p27) was prominently increased in CCl_4+PSO group. These results indicated that hepatotoxicity induced by CCl_4 could be aggravated by intraperitoneal administration with PSO, and the repair process of liver could be delayed. The preliminary mechanism may be related to the inhibition of PCNA and regulation of some cell cycle-associated protein by psoralen, in which the significant up-regulation of p27, p53 and p21 may play important roles.