融合型ニコチンアセチルコリン受容体の異種発現：サブユニットの融合の長所と短所、およびコンストラクトデザインの推奨事項

Heterologous expression of concatenated nicotine acetylcholine receptors: pros and cons of subunit concatenation and recommendations for construct designs.

• Vivian Wan Yu Liao
• Ali Saad Kusay
• Thomas Balle
• Philip Kiaer Ahring

抄録

背景と目的:

Cysループ受容体サブユニットの連結は、受容体アセンブリの実験的制御を確実にするために一般的に使用されている技術である。しかし、我々は最近、広く使用されているコンストラクトでは、三元系やより複雑な受容体の均一なプールの発現にはつながらないことを実証した。したがって、その目的は、結果として得られる受容体プールを厳密に制御できるような連結コンストラクトを設計するための実行可能な戦略を特定することであった。

BACKGROUND AND PURPOSE: Concatenation of Cys-loop receptor subunits is a commonly used technique to ensure experimental control of receptor assembly. However, we recently demonstrated that widely used constructs did not lead to the expression of uniform pools of ternary and more complex receptors. The aim was therefore to identify viable strategies for designing concatenated constructs that would allow strict control of resultant receptor pools.

実験的アプローチ:

二量体、四量体、五量体のα4β2含有nACh受容体コンストラクトを、リンカー長を順次短くして設計し、Xenopus laevis卵母細胞で発現させた。その結果得られた受容体の化学量論は、二電極電圧クランプ実験の機能解析により検討された。また、分子動力学シミュレーションにより、リンカーがコンカテマーの3次元構造に及ぼす影響を調べた。

EXPERIMENTAL APPROACH: Concatenated dimeric, tetrameric and pentameric α4β2-containing nACh receptor constructs were designed with successively shorter linker lengths and expressed in Xenopus laevis oocytes. Resulting receptor stoichiometries were investigated by functional analysis in two-electrode voltage clamp experiments. Molecular dynamics simulations were performed to investigate potential effect of linkers on the 3D-structure of concatemers.

主要な結果:

その結果、二量体構造は信頼性が低く、三元受容体の発現には適していないことがわかった。2つの短いリンカーを導入することで、4量体と5量体のコンセプタープールを効率的に発現させることができた。しかし、リンカーは短すぎても、コンカテマーの立体構造に負担をかけることになるので、短すぎてはいけません。

KEY RESULTS: Dimeric constructs were found to be unreliable and should be avoided for expression of ternary receptors. By introducing two short linkers, we obtained efficient expression of uniform receptor pools with tetrameric and pentameric constructs. Yet, linkers should not be excessively short as that introduces strain on the 3D-structure of concatemers.

結論と意義:

このデータは、連結されたCys-loopレセプターの設計には、アセンブリの制御を望むことと、結果として得られるタンパク質へのひずみの導入を避けることとの間の妥協点が必要であることを示している。全体的に最良の戦略は、慎重に最適化されたリンカーの長さを持つ五員環構造であることが判明した。我々の知見は、三元系またはそれ以上に複雑なCys-loop受容体の研究を大幅に促進するだけでなく、薬理学的薬剤が化学量論的に特異的な結合部位とどのように相互作用するかを詳細に解析することを可能にするだろう。

CONCLUSION AND IMPLICATIONS: The data demonstrate that design of concatenated Cys-loop receptors requires a compromise between the desire for control of assembly and avoiding introduction of strain on the resulting protein. The overall best strategy was found to be pentameric constructs with carefully optimised linker lengths. Our findings will significantly facilitate studies of ternary or more complex Cys-loop receptors as well as enabling detailed analysis of how pharmacological agents interact with stoichiometry-specific binding sites.

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