GABA型A受容体のα2サブユニットのSer359上のリン酸化は、抑制性シナプスでの密度を低下させる

Phosphorylation on Ser 359 of the α2 subunit in GABA type A receptors down-regulates their density at inhibitory synapses.

• Yasuko Nakamura
• Danielle H Morrow
• Anna J Nathanson
• Jeremy M Henley
• Kevin A Wilkinson
• Stephen J Moss

抄録

GABA型A受容体（GABAR）は、高速なシナプス抑制を媒介し、機能的に多様なシナプスに輸送されている。しかし、これらの受容体のシナプス標的化を調節する正確な分子機構は不明である。GABARのα4, β, γサブユニットのリン酸化イベントがGABARの機能とトラフィッキングを支配していることは以前に示されているが、他のサブユニットのリン酸化はまだ実証されていない。ここでは、GABARのα2サブユニットがSer 359でリン酸化されており、GABARが足場タンパク質であるゲフィリンとコリービスティンへの結合を動的に制御できることを示している。我々は最初にMS分析によりSer 359リン酸化を同定し、追加の実験により、このリン酸化がcAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)とプロテインホスファターゼ1(PP1)および/またはPP2Aの活性によって制御されていることを明らかにした。GSTベースのプルダウンおよび共沈実験は、WTおよびS359Aホスホヌル変異体へのゲフィリンおよびコリービスティンの両方の優先的な結合を示したが、S359Dホスホミメティック変異体への結合は示さなかった。さらに、コリービスティンとゲフィリンを結合するα2 S359D変異体の能力の低下は、シナプスα2含有GABAARクラスターの密度を低下させ、軸索初期セグメントにおけるα2濃縮の欠如を引き起こした。これらの結果は、α2サブユニットのPKA介在性リン酸化とPP1/PP2A依存性脱リン酸化が、抑制性シナプスにおけるGABAR蓄積のダイナミックな調節に役割を果たし、それによってシナプス抑制の強さを調節していることを示唆している。蛋白質を用いて、そのタンパク質の発現を解析した結果が掲載されています。

GABA type A receptors (GABARs) mediate fast synaptic inhibition and are trafficked to functionally diverse synapses. However, the precise molecular mechanisms that regulate the synaptic targeting of these receptors are unclear. While it has been previously shown that phosphorylation events in α4, β and γ subunits of GABARs govern their function and trafficking, phosphorylation of other subunits has not yet been demonstrated. Here, we show that the α2 subunit of GABARs is phosphorylated at Ser 359 and enables dynamic regulation of GABAR binding to the scaffolding proteins gephyrin and collybistin. We initially identified Ser 359 phosphorylation by MS analysis, and additional experiments revealed that it is regulated by the activities of cAMP-dependent protein kinase (PKA) and the protein phosphatase 1 (PP1) and/or PP2A. GST-based pulldowns and coimmunoprecipitation experiments demonstrate preferential binding of both gephyrin and collybistin to WT and an S359A phosphonull variant, but not to an S359D phosphomimetic variant. Furthermore, the decreased capacity of the α2 S359D variant to bind collybistin and gephyrin decreased the density of synaptic α2-containing GABAAR clusters and caused an absence of α2 enrichment in the axon initial segment. These results suggest that PKA-mediated phosphorylation and PP1/PP2A-dependent dephosphorylation of the α2 subunit play a role in the dynamic regulation of GABAR accumulation at inhibitory synapses, thereby regulating the strength of synaptic inhibition. The MS data have been deposited to ProteomeXchange, with the dataset identifier PXD019597.

Published under license by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.