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非定型的なBRCT-リン酸化ペプチド認識機構がサイトカインシスにおけるRhoA活性化を支配している
A Non-canonical BRCT-Phosphopeptide Recognition Mechanism Underlies RhoA Activation in Cytokinesis.
PMID: 32619481 DOI: 10.1016/j.cub.2020.05.090.
抄録
サイトカインシスは細胞の内容物を分割して有糸分裂を完了させる。サイトキネシスの間に、ポロ様キナーゼ1（PLK1）は小型GTPase RhoAを活性化し、収縮性のあるアクトミオシン環を組み立てる。PLK1は、RhoAのグアニンヌクレオチド交換因子ECT2を集中させる中心紡錘体上のドッキング部位を作ることによって、RhoAの活性化をパターン化することが提案されている。しかし、ECT2が中心紡錘体を標的とした場合、サイトカインシスには必要ないことから、PLK1がどのようにRhoA活性化を制御しているのかは未解明である。この問題を解決するために、我々は2つのRhoA調節因子のうち予測される約100のPLK1部位を標的とした偏りのないアプローチを採用した。ECT2とCYK4とキネシン-6からなるcentralspindlin複合体をターゲットにしたアンバイアスなアプローチを採用しました。この包括的なアプローチにより、機能的に重要なPLK1標的部位はCYK4N末端の1つのクラスターにのみ存在することが示唆された。このクラスターのリン酸化は、CYK4とECT2のBRCTリピートモジュールとの直接的な相互作用を促進した。しかし、インビトロおよびインビボの突然変異解析は、相互作用は、構造的に特徴づけられたBRCT-リン酸化ペプチド相互作用に基づいて、結合のために重要であると推定されたECT2のBRCTリピートモジュールの保存された"正準"残基から独立しているという驚くべき発見につながった。その代わりに、ECT2 BRCTモジュールは、保存された明確な塩基性表面を介してリン酸化CYK4と結合することを示している。基本的な表面の変異は、CYK4クラスターのリン酸化の損失またはPLK1活性の阻害のサイトカインへの影響を模倣しています。ECT2の自己阻害が細胞質内のCYK4との相互作用を制限しているという証拠とともに、これらの結果は、中心紡錘体の周りのリン酸化されたCYK4の空間的勾配が、隣接する形質膜上のECT2と相互作用してRhoAの活性化をパターン化することを示唆している。
Cytokinesis partitions the cell contents to complete mitosis. During cytokinesis, polo-like kinase 1 (PLK1) activates the small GTPase RhoA to assemble a contractile actomyosin ring. PLK1 is proposed to pattern RhoA activation by creating a docking site on the central spindle that concentrates the RhoA guanine nucleotide exchange factor ECT2. However, ECT2 targeting to the central spindle is dispensable for cytokinesis, indicating that how PLK1 controls RhoA activation remains unresolved. To address this question, we employed an unbiased approach targeting ∼100 predicted PLK1 sites in two RhoA regulators: ECT2 and the centralspindlin complex, composed of CYK4 and kinesin-6. This comprehensive approach suggested that the only functionally critical PLK1 target sites are in a single cluster in the CYK4 N terminus. Phosphorylation of this cluster promoted direct interaction of CYK4 with the BRCT repeat module of ECT2. However, mutational analysis in vitro and in vivo led to the surprising finding that the interaction was independent of the conserved "canonical" residues in ECT2's BRCT repeat module that, based on structurally characterized BRCT-phosphopeptide interactions, were presumed critical for binding. Instead, we show that the ECT2 BRCT module binds phosphorylated CYK4 via a distinct conserved basic surface. Basic surface mutations mimic the effects on cytokinesis of loss of CYK4 cluster phosphorylation or inhibition of PLK1 activity. Together with evidence for ECT2 autoinhibition limiting interaction with CYK4 in the cytoplasm, these results suggest that a spatial gradient of phosphorylated CYK4 around the central spindle patterns RhoA activation by interacting with ECT2 on the adjacent plasma membrane.
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