RRE含有転写産物から産生されたVpr.Prot.Cas9タンパク質を担持した非濃縮レンチベクターを用いた高効率な「ヒットアンドラン」ゲノム編集

Highly efficient 'hit-and-run' genome editing with unconcentrated lentivectors carrying Vpr.Prot.Cas9 protein produced from RRE-containing transcripts.

• Ivana Indikova
• Stanislav Indik

抄録

ゲノム編集技術の応用は、RNA誘導エンドヌクレアーゼを標的細胞に送達する安全かつ効率的な方法がないために、現在のところ制限されている。我々は、U6-sgRNAテンプレートとCRISPR関連タンパク質9（Cas9）とウイルス標的タンパク質Vpr（Vpr.Prot.Cas9）が融合した共パッケージ化されたレンチウイルスベースのナノ粒子を工学的に設計し、細胞への同時送達のために。vpr.prot.cas9とgag/pol遺伝子の発現（Rev応答エレメント、RREの存在）を等しく時空間的に制御することにより、融合タンパク質のカプセル化が大幅に増強され、高効率なレンチベクターナノ粒子の生産をもたらした。非濃縮、Vpr.Prot.Cas9含有ベクターの導入は、最小限の細胞毒性でレポーターHEK293-EGFP細胞におけるEGFP遺伝子の98%以上の破壊をもたらした。さらに、リンパ球および単球由来の細胞株では最大100％、CD4+ T細胞では最大15％の頻度で、標的とする内因性遺伝子座のインデルをハイスループットシークエンシングにより検出した。このアプローチは、ゲノム編集酵素の細胞への効率的、用量制御された組織特異的な送達のためのプラットフォームを提供する可能性があり、内因性遺伝子破壊とトランスジェーンの同時送達に適している可能性があります。

The application of gene-editing technology is currently limited by the lack of safe and efficient methods to deliver RNA-guided endonucleases to target cells. We engineered lentivirus-based nanoparticles to co-package the U6-sgRNA template and the CRISPR-associated protein 9 (Cas9) fused with a virion-targeted protein Vpr (Vpr.Prot.Cas9), for simultaneous delivery to cells. Equal spatiotemporal control of the vpr.prot.cas9 and gag/pol gene expression (the presence of Rev responsive element, RRE) greatly enhanced the encapsidation of the fusion protein and resulted in the production of highly efficient lentivector nanoparticles. Transduction of the unconcentrated, Vpr.Prot.Cas9-containing vectors led to >98% disruption of the EGFP gene in reporter HEK293-EGFP cells with minimal cytotoxicity. Furthermore, we detected indels in the targeted endogenous loci at frequencies of up to 100% in cell lines derived from lymphocytes and monocytes and up to 15% in primary CD4+ T cells by high-throughput sequencing. This approach may provide a platform for the efficient, dose-controlled and tissue-specific delivery of genome editing enzymes to cells and it may be suitable for simultaneous endogenous gene disruption and a transgene delivery.

© The Author(s) 2020. Published by Oxford University Press on behalf of Nucleic Acids Research.