CRISPR/Cas9を用いた全ゲノムワイドノックアウトスクリーニングにより、酸素-グルコース欠乏/再灌流抵抗性に関与するミトコンドリアリボソームタンパク質を同定した

CRISPR/Cas9-mediated whole genomic wide knockout screening identifies mitochondrial ribosomal proteins involving in oxygen-glucose deprivation/reperfusion resistance.

• Xinjie Guan
• Hainan Zhang
• Haiyun Qin
• Chunli Chen
• Zhiping Hu
• Jieqiong Tan
• Liuwang Zeng

抄録

脳梗塞の治療には、静脈内血栓溶解療法や血管内治療による再疎通療法が重要である。しかし，再灌流治療は急性脳障害を悪化させ，再灌流障害により生命を脅かすことにもなります。これまでのところ、脳虚血・再灌流障害の発症機序は十分に解明されておらず、有効な治療介入はまだ発見されていないのが現状です。そこで、本研究では、SK-N-BE(2)細胞を酸素-グルコース欠乏/再灌流(OGDR)インシュルトに供し、脳虚血-再灌流障害の新たな治療標的を発見するために、ゲノムワイドCRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeatats)/Cas9(CRISPR-associated protein 9)ノックアウトスクリーニングをプールドスクリーンで行いました。その結果、OGDR耐性に関与している可能性のある遺伝子をMetascapeを用いて同定した。その結果、OGDR耐性に関与する遺伝子は、好中球の脱顆粒、ミトコンドリアの翻訳、アポトーシスプロセスや酸化ストレスへの応答に関与するシステイン型エンドペプチダーゼ活性の調節に主に関与していることが明らかになった。次に、同定された候補遺伝子のいくつかを個別にノックダウンした。その結果、MRPL19, MRPL32, MRPL52, MRPL51 を阻害することで、細胞の生存率が向上し、OGDR によるアポトーシスが抑制されることを示した。また、OGDR が MRPL19 および MRPL51 タンパク質の発現をダウンレギュレートすることも示した。これらのデータは、Cas9 を用いたゲノムスケールのスクリーニングが、OGDR 損傷に反応する細胞システムを解析するための信頼できるツールであることを示唆している。MRPL19とMRPL51はOGDR抵抗性に寄与しており、脳虚血再灌流障害の治療のための有望なターゲットになると考えられている。

Recanalization therapy by intravenous thrombolysis or endovascular therapy is critical for the treatment of cerebral infarction. However, the recanalization treatment will also exacerbate acute brain injury and even severely threatens human life due to the reperfusion injury. So far, the underlying mechanisms for cerebral ischaemia-reperfusion injury are poorly understood and effective therapeutic interventions are yet to be discovered. Therefore, in the research, we subjected SK-N-BE(2) cells to oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGDR) insult and performed a pooled genome-wide CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 (CRISPR-associated protein 9) knockout screen to discover new potential therapeutic targets for cerebral ischaemia-reperfusion injury. We used Metascape to identify candidate genes which might involve in OGDR resistance. We found that the genes contributed to OGDR resistance were primarily involved in neutrophil degranulation, mitochondrial translation, and regulation of cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process and response to oxidative stress. We then knocked down some of the identified candidate genes individually. We demonstrated that MRPL19, MRPL32, MRPL52 and MRPL51 inhibition increased cell viability and attenuated OGDR-induced apoptosis. We also demonstrated that OGDR down-regulated the expression of MRPL19 and MRPL51 protein. Taken together, our data suggest that genome-scale screening with Cas9 is a reliable tool to analyse the cellular systems that respond to OGDR injury. MRPL19 and MRPL51 contribute to OGDR resistance and are supposed to be promising targets for the treatment of cerebral ischaemia-reperfusion damage.

© 2020 The Authors. Journal of Cellular and Molecular Medicine published by Foundation for Cellular and Molecular Medicine and John Wiley & Sons Ltd.