イムノブロットを用いたグリコサミノグリカン鎖の信頼性と感度の高い検出

Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots.

• Haruna Nagase
• Sayuri L Higashi
• Chinyere A Iweka
• Craig S Pearson
• Yoko Hirata
• Herbert M Geller
• Yasuhiro Katagiri

抄録

複雑なグリカンは、細胞内シグナル伝達や器官の発達から腫瘍の増殖に至るまで、多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。グリカンの発現は、細胞や組織へのグリカン特異的抗体の適用によって日常的に評価されています。しかし、グリカン特異的抗体は、非常に多くの場合、イムノブロット上の多数のバンドを示し、信頼性の高いコントロールが欠落している場合、それはデータを解釈することは困難である。これは、糖鎖生物学研究の範囲を制限し、複製のための課題を提起しています。我々は、糖鎖ベースのイムノブロットの速度と品質を大幅に向上させるために、免疫反応を強化する技術を利用した新しい戦略を開発することによって、この問題を解決しようとしました。代表的な事例として、コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン（CS-GAG）鎖を炭水化物ターゲットとして、モノクローナル抗体CS-56をプローブとして使用した。我々は、抗体の抗原であるCS-GAG鎖を事前にインキュベートすることで、真陽性のシグナルと偽陽性のシグナルを区別できることを発見した。この方法を抗ヘパラン硫酸GAGs（HS-GAGs）モノクローナル抗体10E4に適用したところ、真陽性シグナルは膜上での化学的なHS-GAGの脱重合によって確認されました。このように、糖鎖特異的抗体は、再現性の高い結果が得られる免疫ブロット上で明確で説得力のあるデータを得ることができるという証拠は、糖鎖生物学におけるライフサイエンス研究の多くの側面に新たな機会を開くものである。

Complex glycans play vital roles in many biological processes, ranging from intracellular signaling and organ development to tumor growth. Glycan expression is routinely assessed by the application of glycan-specific antibodies to cells and tissues. However, glycan-specific antibodies quite often show a large number of bands on immunoblots and it is hard to interpret the data when reliable controls are lacking. This limits the scope of glycobiology studies and poses challenges for replication. We sought to resolve this issue by developing a novel strategy that utilizes an immunoreaction enhancing technology to vastly improve the speed and quality of glycan-based immunoblots. As a representative case study, we used chondroitin sulfate glycosaminoglycan (CS-GAG) chains as the carbohydrate target and a monoclonal antibody, CS-56, as the probe. We discovered that pre-incubation of the antibody with its antigenic CS-GAG chain distinguishes true-positive signals from false-positive ones. We successfully applied this strategy to 10E4, a monoclonal anti heparan sulfate GAGs (HS-GAGs) antibody, where true-positive signals were confirmed by chemical HS-GAG depolymerization on the membrane. This evidence that glycan-specific antibodies can generate clear and convincing data on immunoblot with highly replicable results opens new opportunities for many facets of life science research in glycobiology.

Published by Oxford University Press 2020.