細胞生物学と癌診断におけるアプリケーションのためのレクチンと免疫組織化学（CLIH）の組み合わせ。ヒト尿路上皮癌の分析

Combined lectin- and immuno-histochemistry (CLIH) for applications in cell biology and cancer diagnosis: Analysis of human urothelial carcinomas.

• Daša Zupančič
• Mateja Erdani Kreft
• Igor Sterle
• Rok Romih

抄録

レクチン組織化学（LHC）と免疫組織化学（IHC）は、それぞれ細胞膜中の糖残基とタンパク質の組成と局在を示すもので、一般的には別々に使用されています。これら2つの方法を用いて、私たちは以前、尿道粘膜細胞の悪性形質転換がタンパク質のグリコシル化の変化と尿道粘膜特異的な膜タンパク質ウロプラキン（UPs）の発現低下をもたらすことを実証しました。しかし、これらの変化の間には相関関係があるかどうかについては、これまで研究されていませんでした。この相関関係を評価するために、私たちは画期的な方法を開発しました。我々は、6 つの正常な尿道粘膜と 9 つの乳頭状尿道粘膜癌、すなわち、3 つの低悪性度乳頭状尿道粘膜新生物（PUNLMP）、3 つの低悪性度非浸潤性乳頭状尿道粘膜癌（pTa、l.g.）、3 つの高悪性度浸潤性乳頭状尿道粘膜癌（pT1、h.g.）のヒト生検を使用しました。我々は、パラフィン切片およびクライオセミチン切片上でCLIHの5つの異なるプロトコル（番号1～5）を試験し、別々に実施されたLHCおよびIHCと比較した。さらに、UPsおよびレクチンAmaranthus caudatus agglutinin（ACA）、Datura stramonium agglutin（DSA）およびjacalinに対する抗体を用いて、それぞれウエスタンブロッティングおよびレクチンブロッティングを行った。我々は、最初に一次抗体を用いてインキュベートし、その後、二次抗体とレクチンの混合物を用いてインキュベートすることが最も効率的なCLIH法であることを示した（プロトコル番号5）。さらに、厚さ300nmのクライオセミチン切片は、厚さ5μmのパラフィン切片よりも、糖残基とタンパク質間の共局在のより良い分解能を可能にした。正常な尿道粘膜では、CLIHは表在性の傘細胞のapical plasma membrane (PM)において、レクチンACAとジャカリンがUPと共局在していることを示した。乳頭性尿道粘膜癌では、3つのレクチン（ACA、DSA、およびジャカリン）すべてが、UPsと時折共局在しているapical plasma membrane（PM）の領域を標識していた。ウェスタンおよびレクチンブロッティングにより、正常な尿道粘膜と乳頭状尿道粘膜がんの違いが確認された。我々の結果は、様々なレクチンおよび抗原のセットで使用される場合、CLIHは有用で迅速かつ信頼性の高い方法であり、ヒト尿路粘膜癌の詳細なサブタイプ分類だけでなく、基礎的な細胞生物学研究にも応用できることを示している。

Lectin histochemistry (LHC) and immunohistochemistry (IHC), which demonstrate the composition and localisation of sugar residues and proteins in cell membranes, respectively, are generally used separately. Using these two methods, we previously demonstrated that malignant transformation of urothelial cells results in the alterations of protein glycosylation and reduced expression of urothelium-specific integral membrane proteins uroplakins (UPs). However, the correlation between these changes was not studied yet. To evaluate this correlation, we developed innovative method, which we named combined lectin- and immuno- histochemistry (CLIH). We used human biopsies of 6 normal urothelia and 9 papillary urothelial carcinomas, i.e. 3 papillary urothelial neoplasms of low malignant potential (PUNLMP), 3 non-invasive papillary urothelial carcinomas of low grade (pTa, l.g.), and 3 invasive papillary urothelial carcinomas of high grade (pT1, h.g.). We tested five different protocols (numbered 1-5) of CLIH on paraffin and cryo-semithin sections and compared them with LHC and IHC performed separately. Additionally, we carried out western and lectin blotting with antibodies against UPs and lectins Amaranthus caudatus agglutinin (ACA), Datura stramonium agglutinin (DSA), and jacalin, respectively. We showed that incubation with primary antibodies first, followed by the mixture of secondary antibodies and lectins is the most efficient CLIH method (protocol number 5). Additionally, 300 nm thick cryo-semithin sections enabled better resolution of co-localisation between sugar residues and proteins than 5 µm thick paraffin sections. In the normal urothelium, CLIH showed co-localisation of lectins ACA and jacalin with UPs in the apical plasma membrane (PM) of superficial umbrella cells. In papillary urothelial carcinomas, all three lectins (ACA, DSA and jacalin) labelled regions of apical PM, where they occasionally co-localised with UPs. Western and lectin blotting confirmed the differences between normal urothelium and papillary urothelial carcinomas. Our results show that CLIH, when used with various sets of lectins and antigens, is a useful, quick, and reliable method that could be applied for basic cell biology research as well as detailed subtyping of human urothelial carcinomas.