細胞内pHメッセンジャーとしてのアップコンバージョンナノ粒子

Upconversion nanoparticles as intracellular pH messengers.

• Evaline S Tsai
• Fadwa Joud
• Lisa M Wiesholler
• Thomas Hirsch
• Elizabeth A H Hall

抄録

アップコンバージョンナノ粒子（UCNP）は、蛍光顕微鏡を用いてほぼリアルタイムでサブマイクロメートルの寸法までイメージングすることができ、細胞イメージングアプリケーションで一般的に遭遇するフォトブリーチング、自家蛍光、深部組織への浸透などの問題を克服できるため、細胞内の測定に特に適していると考えられる。本研究では、pH感受性色素（pHAb）で修飾したUCNPの性能を研究した。色素(発光波長580nm)をポリエチレンイミン(PEI)でコーティングしたUCNPに付着させ、980nmの励起下で540nmのUCNP発光を介して励起した。これらの結果から、UC共鳴エネルギー伝達効率は25〜30%であり、フェルスター距離は2.56nmであることが予測された。ヒト神経芽腫細胞SH-SY5Y細胞をナイゲリシンH/Kイオノフォアで平衡化し、細胞内および細胞外pHを平衡化したところ、UCNP-pHAb複合体粒子の取り込みが認められ、pHAb発光チャネル（565-630nm）とUCNP赤色発光チャネル（640-680nm）の強度比をとると、UCNP-pHAbの見かけのpKが5.1であるシグモイドpH応答曲線が得られた。UCNP-pHAbは、リソソソームマーカーであるLysoBrite色素とコロケーションすることが示された。ナノ粒子の細胞内への取り込み機構を解明するために、クラスリン媒介エンドサイトーシスを阻害するクロルプロマジン（CPZ）やカベオラ媒介エンドサイトーシスを阻害するナイスタチン（NYS）などの薬物阻害剤を検討した。この予備的研究により，UCNP-pHAb のような pH 指示薬修飾 UCNP が SH-SY5Y 細胞内の pH を報告できること，およびナノ粒子の細胞内への取り込みは，クラスリン媒介エンドサイトーシスを介して起こることが示唆された．グラフィカルアブストラクト。

Upconversion nanoparticles (UCNPs) should be particularly well suited for measurement inside cells because they can be imaged down to submicrometer dimensions in near real time using fluorescence microscopy, and they overcome problems, such as photobleaching, autofluorescence, and deep tissue penetration, that are commonly encountered in cellular imaging applications. In this study, the performance of an UCNP modified with a pH-sensitive dye (pHAb) is studied. The dye (emission wavelength 580 nm) was attached in a polyethylene imine (PEI) coating on the UCNP and excited via the 540-nm UCNP emission under 980-nm excitation. The UC resonance energy transfer efficiencies at different pHs ranged from 25 to 30% and a Förster distance of 2.56 nm was predicted from these results. Human neuroblastoma SH-SY5Y cells, equilibrated with nigericin H/K ionophore to equalize the intra- and extracellular pH' showed uptake of the UCNP-pHAb conjugate particles and, taking the ratio of the intensity collected from the pHAb emission channel (565-630 nm) to that from the UCNP red emission channel (640-680 nm), produced a sigmoidal pH response curve with an apparent pK for the UCNP-pHAb of ~ 5.1. The UCNP-pHAb were shown to colocalize with LysoBrite dye, a lysosome marker. Drug inhibitors such as chlorpromazine (CPZ) and nystatin (NYS) that interfere with clathrin-mediated endocytosis and caveolae-mediated endocytosis, respectively, were investigated to elucidate the mechanism of nanoparticle uptake into the cell. This preliminary study suggests that pH indicator-modified UCNPs such as UCNP-pHAb can report pH in SH-SY5Y cells and that the incorporation of the nanoparticles into the cell occurs via clathrin-mediated endocytosis. Graphical abstract.