生物学的システムにおけるヒトUGT1A1活性を検出するための超高感度で使いやすいアッセイ法です

An ultra-sensitive and easy-to-use assay for sensing human UGT1A1 activities in biological systems.

• Ya-Di Zhu
• Hui-Lin Pang
• Qi-Hang Zhou
• Zi-Fei Qin
• Qiang Jin
• Moshe Finel
• Yi-Nan Wang
• Wei-Wei Qin
• Yin Lu
• Dan-Dan Wang
• Guang-Bo Ge

抄録

ヒトUDP-グルクロン酸転移酵素1A1（UGT1A1）は、最も重要な結合酵素の一つであり、ビリルビンをはじめとする内因性物質や多くの異なる外来物質の代謝・解毒に関与しています。UGT1A1とヒトの疾患との関連性を解読し、UGT1A1の活性に対する低分子の効果を特徴付けるためには、複雑な生物学的マトリックス中でのこの重要な酵素の機能を調べるための信頼性の高いツールが必要である。ここでは、蛍光検出付き液体クロマトグラフィー（LC-FD）を用いて、様々な生物学的マトリックス中のUGT1A1活性を高選択的かつ高感度にモニタリングするための使いやすいアッセイ法を開発し、その妥当性を検証した。新たに開発したLC-FDベースのアッセイは、感度、特異性、精度、定量的な直線範囲、安定性の面で確認されています。その主な利点の一つは、同じプローブ基質を使用した従来のアッセイと比較して、検出限界と定量限界が約100倍に低下し、他のどの方法よりも少量の活性酵素を確実に定量することができることです。精度試験では、日内変動、日間変動ともに5.5%以下であることが確認されました。さらに、新たに開発したアッセイ法は、生きた細胞におけるUGT1A1の発現レベルに対する低分子の調節効果をスクリーニングし、特徴づけるのにも成功しています。このように、様々な生物学的系での UGT1A1 活性を超高感度に測定できる使いやすい LC-FD 法を開発し、ヒト疾患における UGT1A1 の役割、外来生物との相互作用、低分子の UGT1A1 抱合酵素への修飾効果の特徴付けなど、安価で実用的なアプローチを提供しています。

The human UDP-glucuronosyltransferase 1A1 (UGT1A1), one of the most essential conjugative enzymes, is responsible for the metabolism and detoxification of bilirubin and other endogenous substances, as well as many different xenobiotic compounds. Deciphering UGT1A1 relevance to human diseases and characterizing the effects of small molecules on the activities of UGT1A1 requires reliable tools for probing the function of this key enzyme in complex biological matrices. Herein, an easy-to-use assay for highly-selective and sensitive monitoring of UGT1A1 activities in various biological matrices, using liquid chromatography with fluorescence detection (LC-FD), has been developed and validated. The newly developed LC-FD based assay has been confirmed in terms of sensitivity, specificity, precision, quantitative linear range and stability. One of its main advantages is lowering the limits of detection and quantification by about 100-fold in comparison to the previous assay that used the same probe substrate, enabling reliable quantification of lower amounts of active enzyme than any other method. The precision test demonstrated that both intra- and inter-day variations for this assay were less than 5.5%. Furthermore, the newly developed assay has also been successfully used to screen and characterize the regulatory effects of small molecules on the expression level of UGT1A1 in living cells. Overall, an easy-to-use LC-FD based assay has been developed for ultra-sensitive UGT1A1 activities measurements in various biological systems, providing an inexpensive and practical approach for exploring the role of UGT1A1 in human diseases, interactions with xenobiotics, and characterization modulatory effects of small molecules on this conjugative enzyme.

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