Rab1b-GBF1-ARFsを介した細胞内輸送は、豚臍帯静脈内皮細胞における古典的な豚熱ウイルスの複製に必要である

Rab1b-GBF1-ARFs mediated intracellular trafficking is required for classical swine fever virus replication in swine umbilical vein endothelial cells.

• Liang Zhang
• Tao Wang
• Mengzhao Song
• Mingxing Jin
• Shanchuan Liu
• Kangkang Guo
• Yanming Zhang

抄録

プラスセンスRNAウイルスである古典的豚熱ウイルス（CSFV）は、宿主の細胞内膜小器官を複製に利用する。我々のこれまでの研究では、細胞内膜輸送イベントを阻害することでCSFVの複製を抑制できることが示されている。しかし、CSFV感染におけるこのプロセスの根本的なメカニズムは明らかにされていませんでした。CSFV複製におけるゴルジ体関連の前向性および逆行性トラフィッキングの役割を決定するために、ゴルジ体とER阻害剤ブレフェルディンA（BFA）およびGBF1阻害剤ゴルジサイドA（GCA）である2,2-メチル-N-（2,4,6,-トリメトキシフェニル）ドデカンアミド（CI-976）との間の小胞輸送がウイルス産生に及ぼす影響を明らかにした。その結果、BFA, CI-976, GCAによる小胞輸送の阻害がCSFV感染を有意に抑制することが明らかになった。その後、レンチウイルスによるRab1bのノックダウンおよび陰性変異体Rab1b-N121IによるCSFV感染抑制効果を明らかにした。さらに、Rab1b下流の小胞成分エフェクターGBF1、クラスIおよびクラスIIのADPリボシル化因子（ARF）もウイルス複製に関与していることを明らかにした。さらに、共焦点顕微鏡アッセイにより、CSFV感染によりゴルジ体が破壊され、その結果、核周辺のゴルジ体分布が拡大することが示された。また、ガウスルシフェラーゼフラッシュアッセイを用いて測定した細胞分泌経路は、CSFV感染細胞ではブロックされていることを示した。これらの知見は、CSFVがRab1b-GBF1-ARFsを媒介としたトラフィッキングを利用して自らの複製を促進していることを示している。これらの知見はまた、CSFVのライフサイクルに利用される細胞内輸送経路についての新たな知見を提供するものである。

Classical swine fever virus (CSFV), a plus-sense RNA virus, utilizes host intracellular membrane organelles for its replication. Our previous studies have shown that disruption of the intracellular membrane-trafficking events can inhibit CSFV replication. However, the underlying mechanism of this process in CSFV infection has not been elucidated. To determine the role of Golgi-associated anterograde and retrograde trafficking in CSFV replication, we revealed the effect of vesicular transport between Golgi and ER inhibitors Brefeldin A (BFA) and 2,2-methyl-N-(2,4,6,-trimethoxyphenyl) dodecanamide (CI-976), the GBF1 inhibitor golgicide A (GCA) on virus production. Our results showed that disruption of vesicular trafficking by BFA, CI-976, and GCA significantly inhibited CSFV infection. Subsequent experiments revealed that knockdown of Rab1b by lentiviruses and negative-mutant Rab1b-N121I transfection inhibited CSFV infection. Furthermore, we showed that the Rab1b downstream vesicular component effectors GBF1, and class I and class II ADP-ribosylation factors (ARFs) were also involved in virus replication. In addition, confocal microscopy assay showed that CSFV infection disrupted the Golgi apparatus resulting in extended Golgi distribution around the nucleus. We also showed that cell secretory pathway, measured using Gaussia luciferase flash assay, was blocked in CSFV infected cells. Taken together, these findings demonstrate that CSFV utilizes Rab1b-GBF1-ARFs mediated trafficking to promote its own replication. These findings also provide new insights into the intracellular trafficking pathways utilized for CSFV life cycle.

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