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大腸癌細胞におけるGOLPH3/AKT1/mTOR軸を介した化学療法誘発ゴルジ装置断片化の保護におけるmiR-3135bの新規な役割
A novel protective role for microRNA-3135b in Golgi apparatus fragmentation induced by chemotherapy via GOLPH3/AKT1/mTOR axis in colorectal cancer cells.
PMID: 32601379 PMCID: PMC7324564. DOI: 10.1038/s41598-020-67550-0.
抄録
化学療法は細胞質のDNA損傷反応を活性化し、ゴルジ体の断片化と癌細胞の生存をもたらす。このメカニズムは、ゴルジ体リン酸化タンパク質-3（GOLPH3）/Myo18A/F-アクチン軸によって制御されています。私たちは、機能未知のノンコーディングRNAであるmiR-3135bの機能を解析したところ、miR-3135bが強制的に過剰発現することで、大腸がん細胞において化学療法剤によるゴルジ体の断片化が抑制されることを発見しました。まず、miR-3135bがCRC細胞株や臨床腫瘍でダウンレギュレーションされていることを発見しました。その結果、miR-3135bは細胞生存、化学療法抵抗性、ゴルジ体動態に関与するタンパク質コード遺伝子を制御している可能性があることがバイオインフォマティクス的に予測された。その結果、miR-3135bをHCT-15癌細胞に異所的にトランスフェクションすると、細胞増殖が有意に抑制され、5-FU（5-フルラシル）に感作され、後期アポトーシスや壊死が促進されることが明らかになった。また、miR-3135b の過剰発現は HCT-15 および SW-480 癌細胞の細胞周期の進行を阻害した。また、ゴルジ構造維持に関わる遺伝子であるGOLPH3がmiR-3135bの標的となることが予想されたため、化学療法によるDNA損傷に対するGOLPH3の機能関係を検討した。その結果、5-FUとドキソルビシンは、HCT-15細胞とSW-480細胞の両方において、ゴルジ体リボン構造のアポトーシスに依存しないスタック分散をもたらすことが明らかになった。また、これらの細胞効果は、miR-3135b模倣体のトランスフェクションによって劇的に阻害された。さらに、miR-3135bはGOLPH3プロトオンコジーンの3'-UTRに結合し、細胞生存やオートファジー活性化の鍵を握るp-AKT1（Ser473）やp-mTOR（Ser2448）のシグナル伝達物質のレベルを低下させることが機能的に確認された。さらに、5-FUで処理した後、TGN38因子は、断片化されたゴルジ体に関連する離散構造において、ベクリン-1オートファジータンパク質と共免疫局在化することを見出し、プロサバイバルオートファジーの活性化がゴルジ体の完全性の喪失と関連していることを示唆している。これらのオートファジーとゴルジ体分散の細胞効果は、miR-3135bによって逆転した。以上のことから、大腸がん細胞におけるGOLPH3/AKT1/mTOR軸を介した化学療法誘発ゴルジ断片化の抑制とオートファジーの保護において、miR-3135bが新たな役割を果たしていることを初めて実験的に示した。
Chemotherapy activates a novel cytoplasmic DNA damage response resulting in Golgi apparatus fragmentation and cancer cell survival. This mechanism is regulated by Golgi phosphoprotein-3 (GOLPH3)/Myo18A/F-actin axis. Analyzing the functions of miR-3135b, a small non-coding RNA with unknown functions, we found that its forced overexpression attenuates the Golgi apparatus fragmentation induced by chemotherapeutic drugs in colorectal cancer (CRC) cells. First, we found that miR-3135b is downregulated in CRC cell lines and clinical tumors. Bioinformatic predictions showed that miR-3135b could be regulating protein-encoding genes involved in cell survival, resistance to chemotherapy, and Golgi dynamics. In agreement, ectopic transfection of miR-3135b in HCT-15 cancer cells significantly inhibited cell proliferation, sensitized cells to 5-fluoruracil (5-FU), and promoted late apoptosis and necrosis. Also, miR-3135b overexpression impaired the cell cycle progression in HCT-15 and SW-480 cancer cells. Because GOLPH3, a gene involved in maintenance of Golgi structure, was predicted as a potential target of miR-3135b, we studied their functional relationships in response to DNA damage induced by chemotherapy. Immunofluorescence and cellular ultrastructure experiments using antibodies against TGN38 protein, a trans-Golgi network marker, showed that 5-FU and doxorubicin treatments result in an apoptosis-independent stacks dispersal of the Golgi ribbon structure in both HCT-15 and SW-480 cells. Remarkably, these cellular effects were dramatically hindered by transfection of miR-3135b mimics. In addition, our functional studies confirmed that miR-3135b binds to the 3'-UTR of GOLPH3 proto-oncogene, and also reduces the levels of p-AKT1 (Ser473) and p-mTOR (Ser2448) signaling transducers, which are key in cell survival and autophagy activation. Moreover, we found that after treatment with 5-FU, TGN38 factor coimmunolocalizes with beclin-1 autophagic protein in discrete structures associated with the fragmented Golgi, suggesting that the activation of pro-survival autophagy is linked to loss of Golgi integrity. These cellular effects in autophagy and Golgi dispersal were reversed by miR-3135b. In summary, we provided experimental evidence suggesting for the first time a novel role for miR-3135b in the protection of chemotherapy-induced Golgi fragmentation via GOLPH3/AKT1/mTOR axis and protective autophagy in colorectal cancer cells.