ショウジョウバエメラノガスターにおけるFADDアミロイド線維の形成と免疫シグナル伝達における役割

[Formation of FADD amyloid fiber and its role in immune signaling in Drosophila melanogaster].

• Xinyi Wang
• Xiaoyi Xiao
• Chang Sun
• Fei Wang

抄録

本研究では、ショウジョウバエの自然免疫シグナル伝達経路の調節機構をより良く理解するために、ショウジョウバエメラノガスターFADD(Fas-associated death domain-containing protein)アミロイド繊維の形成とIMD(Immune deficiency)シグナル伝達経路におけるシグナル伝達への影響を研究し、他の種の免疫調節の参考となるようにした。まず、大腸菌で発現したdFADDタンパク質を精製し、イオウフラビンT結合および透過型電子顕微鏡検査を行い、in vitroで形成されたdFADDアミロイド線維を同定した。次に、SDD-AGEと共焦点顕微鏡を用いて、S2細胞におけるdFADDポリマーの形成を調べた。また、dFADD変異体を作製し、どのドメインが繊維形成に必須であるか、また、そのドメインがIMDシグナル伝達に及ぼす影響を調べた。その結果、dFADDはin vitroおよび細胞内でアミロイド繊維ポリマーを形成することが明らかになった。また、DEDドメインを欠失した変異体はモノマーとして存在していたため、繊維の形成はdFADDのDED(Death-effector domain)ドメインに依存していることが明らかになった。その結果、DEDドメインが無傷であることから、繊維形成がIMDシグナル伝達の鍵を握っていることが明らかになった。今回の研究により、アミロイド線維の形成によるIMDシグナル伝達経路におけるDEDDとIMD間のカスケードを媒介するdFADDの役割が明らかになり、自然免疫シグナル伝達経路の進化的に保存された制御機構が示唆された。

In this research, we studied the formation of Drosophila melanogaster FADD (Fas-associated death domain-containing protein) amyloid fiber and its influence on signal transduction in IMD (Immune deficiency) signaling pathway to better understand the regulation mechanism of Drosophila innate immune signaling pathway, which will provide reference for the immune regulation in other species. First, we purified dFADD protein expressed in Escherichia coli and performed Sulfur flavin T binding and transmission electron microscopy to identify the dFADD amyloid fibers formed in vitro. Then we investigated the formation of dFADD polymers in S2 cells using SDD-AGE and confocal microscope. We also constructed dFADD mutants to find out which domain is essential to fiber formation and its effect on IMD signal transduction. Our results revealed that dFADD could be polymerized to form amyloid fiber polymers in vitro and inside the cells. Formation of fibers relies on DED (Death-effector domain) domain of dFADD, since DED domain-deleted mutant existed as a monomer. Dual luciferase reporter assay showed that intact DED domain was required for the induction of downstream antimicrobial peptides, indicating that fiber formation was the key to IMD signal transduction. Our study revealed the role of dFADD in mediating the cascade between IMD and Dredd in the IMD signaling pathway by forming amyloid fibers, suggesting an evolutionarily conserved regulatory mechanism of innate immune signaling pathway.

探究果蝇 FADD（Fas-associated death domain-containing protein） 淀粉样蛋白纤维的形成及对IMD(Immune deficiency) 信号通路中信号传递的影响，有助于更清楚地了解昆虫先天免疫信号通路中的调节机制，为其他物种的免疫调控提供参考。通过原核表达纯化dFADD 蛋白、硫黄素T 结合和透射电子显微镜观察等鉴定dFADD 在体外纤维的形成；通过构建dFADD 真核表达载体，SDD-AGE 检测，共聚焦显微镜观察等探究dFADD在果蝇S2 细胞内纤维聚合物的形成；构建dFADD 结构域突变体，检测纤维形成的关键结构域及对IMD 信号传递的影响。结果表明，dFADD 在体外和细胞水平上都能聚合形成淀粉样蛋白纤维聚合物；纤维的形成是由dFADD的DED（デスエフェクタードメイン）结构域决定的，当DED 结构域缺失时，dFADD 以单体形式存在；双荧光素酶报告系统的检测结束果显示，dFADD 只有形成纤维时，．才能诱导下游抗菌肽的表达，表明纤维形成是IMD 信号传递的关键。本研究揭示了dFADD 通过形成淀粉样蛋白纤维参与IMD 信号通路中介导IMD 与Dredd 级联传导的作用，进一步加深了对淀粉样蛋白纤维不仅在哺乳动物，也在昆虫的免疫信号通路中传递信号这一保守功能的认识。

探究果蝇 FADD (Fas-associated death domain-containing protein) 淀粉样蛋白纤维的形成及对IMD(Immune deficiency) 信号通路中信号传递的影响，有助于更清楚地了解昆虫先天免疫信号通路中的调节机制，为其他物种的免疫调控提供参考。通过原核表达纯化dFADD 蛋白、硫黄素T 结合和透射电子显微镜观察等鉴定dFADD 在体外纤维的形成；通过构建dFADD 真核表达载体，SDD-AGE 检测、共聚焦显微镜观察等探究dFADD在果蝇S2 细胞内纤维聚合物的形成；构建dFADD 结构域突变体，检测纤维形成的关键结构域及对IMD 信号传递的影响。结果表明，dFADD 在体外和细胞水平上都能聚合形成淀粉样蛋白纤维聚合物；纤维的形成是由dFADD的DED (Death-effector domain) 结构域决定的，当DED 结构域缺失时，dFADD 以单体形式存在；双荧光素酶报告系统的检测结果显示，dFADD 只有形成纤维时，才能诱导下游抗菌肽的表达，表明纤维形成是IMD 信号传递的关键。本研究揭示了dFADD 通过形成淀粉样蛋白纤维参与IMD 信号通路中介导IMD 与Dredd 级联传导的作用，进一步加深了对淀粉样蛋白纤维不仅在哺乳动物，也在昆虫的免疫信号通路中传递信号这一保守功能的认识。.