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エクイヌ脂肪間葉系幹細胞におけるCRISPR/Cas9技術によるプロスタグランジンE2受容体EP2およびEP4のエディション
Edition of Prostaglandin E2 Receptors EP2 and EP4 by CRISPR/Cas9 Technology in Equine Adipose Mesenchymal Stem Cells.
PMID: 32585798 PMCID: PMC7341266. DOI: 10.3390/ani10061078.
抄録
間葉系幹細胞（MSC）では、EP2 および EP4 受容体のプロスタグランジン E2（PGE2）刺激が遊走、自己複製、生存、増殖などのプロセスを誘発し、その活性化がホーミングに関与していることが報告されている。本研究の目的は、CRISPR/Cas9 システムを用いて受容体遺伝子 EP2 と EP4 を別々に編集した遺伝子改変脂肪（aMSC）モデルを確立することである。遺伝子編集後、MSC表面マーカーの発現に影響があるかどうか、また、生成した細胞のin vitroでの遊走能に影響があるかどうかを評価した。チリ産仔馬から脂肪ＭＳＣを得て、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ高グルコース中で培養し、ｓｇＲＮＡを線状化したＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２ＧＦＰベクターにクローニングし、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクションして、ａＭＳＣをトランスフェクションするためのウイルス粒子を作製した。GFP発現細胞を選別して分離し、個々のクローンを得た。ゲノムDNAを増幅し、T7E1を用いて部位特異的変異頻度を評価し、次いでサンガーシークエンシングを行った。EP2の11クローンとEP4の10クローンを選択し、サンガーシークエンシングにより、aMSC/EP2に対するノックアウトクローン1クローンとaMSC/EP4のヘテロ接合変異クローン1クローンを確認した。編集した細胞はいずれも野生型と比較してEP2およびEP4受容体の発現が低下しており、EP2およびEP4のエディションはMSC表面マーカーの発現に影響を与えず、スクラッチを埋める際に同じパターンを示していた。これらの受容体のaMSCsにおけるエディションは、野生型と比較しても、表面マーカーの表現型や遊走能に影響を与えないと結論づけることができる。
In mesenchymal stem cells (MSCs), it has been reported that prostaglandin E2 (PGE2) stimulation of EP2 and EP4 receptors triggers processes such as migration, self-renewal, survival, and proliferation, and their activation is involved in homing. The aim of this work was to establish a genetically modified adipose (aMSC) model in which receptor genes EP2 and EP4 were edited separately using the CRISPR/Cas9 system. After edition, the genes were evaluated as to if the expression of MSC surface markers was affected, as well as the migration capacity in vitro of the generated cells. Adipose MSCs were obtained from Chilean breed horses and cultured in DMEM High Glucose with 10% fetal bovine serum (FBS). sgRNA were cloned into a linearized LentiCRISPRv2GFP vector and transfected into HEK293FT cells for producing viral particles that were used to transduce aMSCs. GFP-expressing cells were separated by sorting to obtain individual clones. Genomic DNA was amplified, and the site-directed mutation frequency was assessed by T7E1, followed by Sanger sequencing. We selected 11 clones of EP2 and 10 clones of EP4, and by Sanger sequencing we confirmed 1 clone knock-out to aMSC/EP2 and one heterozygous mutant clone of aMSC/EP4. Both edited cells had decreased expression of EP2 and EP4 receptors when compared to the wild type, and the edition of EP2 and EP4 did not affect the expression of MSC surface markers, showing the same pattern in filling the scratch. We can conclude that the edition of these receptors in aMSCs does not affect their surface marker phenotype and migration ability when compared to wild-type cells.