インディアンラッセル毒由来の神経成長因子（RVV-NGFa）は、乳がん細胞に発現するTrkA受容体に高親和性で結合している。蛍光標識RVVV-NGFaの乳がん臨床診断への応用

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Biochimie.2020 Jun;176:31-44. S0300-9084(20)30136-X. doi: 10.1016/j.biochi.2020.06.004.Epub 2020-06-23.

インディアンラッセル毒由来の神経成長因子（RVV-NGFa）は、乳がん細胞に発現するTrkA受容体に高親和性で結合している。蛍光標識RVVV-NGFaの乳がん臨床診断への応用

Nerve growth factor from Indian Russell's viper venom (RVV-NGFa) shows high affinity binding to TrkA receptor expressed in breast cancer cells: Application of fluorescence labeled RVV-NGFa in the clinical diagnosis of breast cancer.

Taufikul Islam
Munmi Majumder
Anil Bidkar
Siddhartha S Ghosh
Rupak Mukhopadhyay
Yuri Utkin
Ashis K Mukherjee

PMID: 32585227 DOI: 10.1016/j.biochi.2020.06.004.

抄録

神経成長因子(NGF)は蛇毒に含まれる成分の中でもマイナーであり、無視されてきた成分である。本研究では、インドラッセル毒(RVV)のNGFアイソフォーム(RVVV-NGFa)を精製し、その特徴を明らかにした。RVV-NGFaはm/z 17388.725Daのプロトン化分子イオン[MH+]を示した。このRVVV-NGFaはPC-12細胞での神経発生を誘導したが、RVVVの特徴的な薬理学的性質である哺乳類細胞での細胞毒性、溶血活性、血小板調節、血液凝固系への干渉は認められなかった。ELISAおよび免疫蛍光マイクロプレートリーダー法により、RVVV-NGFaは乳癌MDA-MB-231およびMCF-7細胞で発現しているTrkA受容体との結合を示したが、抗TrkA抗体（TrkBやTrkCではなく）または抗pNTR抗体を細胞に事前にインキュベートすることにより、この結合は有意に減少した（p<0.05）。RVV-NGFaは、TrkA受容体を欠損した非癌細胞（HEK-293, L6）との間では取るに足らない結合を示した。乳癌細胞のTrkA受容体にRVVV-NGFaを結合させると、リガンド(RVVV-NGFa)-受容体(TrkA)複合体が時間依存的に細胞質に内包されることが明らかになった。その結果、RVVV-NGFaと精製TrkA受容体の細胞質ドメインとの相互作用が確認された。蛍光（FITC）タグ付きRVV-NGFaは、蛍光顕微鏡下で観察され、乳がん細胞に結合した後に蛍光マイクロプレートリーダーアッセイで決定された強い蛍光シグナルを示したが、FITC-RVV-NGFaを非がん細胞であるL6細胞およびHEK-293細胞とインキュベートした後には蛍光シグナルは検出されなかった。FITC/蛍光ナノ粒子タグ付きRVV-NGFaの乳癌のexvivoおよびinvivo診断への臨床応用は非常に有望である。

Nerve growth factor (NGF) is a minor and neglected component of snake venom. Present study describes the purification and characterization of a NGF isoform (RVV-NGFa) from Indian Russell's viper venom (RVV). RVV-NGFa showed a protonated molecular ion [MH+] at m/z 17388.725 Da. The RVV-NGFa induced neuritogenesis in PC-12 cells but did not show cytotoxicity in mammalian cells, hemolytic activity, platelet modulation, and interference in blood coagulation system which are the characteristic pharmacological properties of RVV. By ELISA and immunofluorescence microplate reader assay, the RVV-NGFa showed appreciable binding to TrkA receptor expressed in breast cancer MDA-MB-231 and MCF-7 cells; nevertheless, pre-incubation of cells with anti-TrkA (and not TrkB or TrkC) or anti-pNTR antibody significantly decreased (p < 0.05) this binding. The RVV-NGFa demonstrated insignificant binding with non-cancerous cells (HEK-293, L6) lacking TrkA receptor. The binding of RVV-NGFa to TrkA receptor of breast cancer cells resulted in internalization of ligand (RVV-NGFa)-receptor (TrkA) complex to cell cytoplasm in a time-dependent manner. The spectrofluorometric study demonstrated an interaction between RVV-NGFa and cytosolic domain of the purified TrkA receptor. The fluorescence (FITC)-tagged RVV-NGFa depicted a strong fluorescence signal that was observed under a fluorescence microscope and determined by fluorescence microplate reader assay post binding to breast cancer cells; but no fluorescence signal was detected after incubating FITC-RVV-NGFa with non-cancerous L6 and HEK-293 cells. The clinical application of FITC/fluorescence nanoparticle tagged RVV-NGFa for the ex vivo and in vivo diagnosis of breast cancer is highly promising.