急性前骨髄球性白血病におけるPML-RARα融合転写物の評価のための液滴デジタルPCRアッセイの開発と検証

Development and validation of a droplet digital PCR assay for the evaluation of PML-RARα fusion transcripts in acute promyelocytic leukemia.

• Xi-Wen Jiang
• Si-Ze Chen
• Xiao-Ya Zhu
• Xiao-Xie Xu
• Yue Liu

抄録

急性前骨髄球性白血病（APL）は、迅速な治療が必要な侵攻性疾患です。前骨髄球性白血病蛋白質-レチノイン酸受容体α（PML-RARα）融合遺伝子の相互転座は、APL診断の分子基盤と考えられています。また、PML-RARα融合遺伝子検査は、残存病変を最小限に抑えて治療効果をモニタリングし、APLの急速な病勢進行前に診断を下すために必要不可欠なツールである。本研究では、2 種類の PML-RARα変異体（bcr1 と bcr3）を迅速に検出するための新しい液滴デジタル PCR（ddPCR）アッセイを開発し、その検出限界（LOD）を定量的 PCR（qPCR）と比較しました。その結果、PML-RARαに対するddPCRのLODは0.001%に達し、ddPCRによるPML-RARαの高コピー数サンプルの評価はqPCRとよく相関することが示された。さらに、ddPCRによる臨床検体検査では、bcr-1陽性検体は34％、bcr3陽性検体は24％であった。しかし、qPCR によれば、bcr1 陽性は 30％、bcr3 陽性は 20％であった。また、ddPCRとqPCR反応の一致率は86％であった。最小残存病変をモニタリングしながら、良好に回復した3例のPML-RARα変異率は0.34％に低下した。しかし、bcr3陽性で再発した1例では寛解中の変異率が13％であり、bcr3アイソフォームが回復に影響を与える予後不良因子である可能性が示唆された。以上のことから、今回の結果は、この新しいddPCRアッセイがAPLの治療効果や予後のモニタリングや評価に有用である可能性を示唆している。

Acute promyelocytic leukemia (APL) is an aggressive disease that requires prompt treatment. Promyelocytic leukemia protein-retinoic acid receptor α (PML-RARα) fusion genes resulting from reciprocal translocation are considered a molecular basis for diagnosing APL. Moreover, PML-RARα fusion gene testing is an essential tool for monitoring the response to therapy via minimal residual disease and providing a diagnosis before rapid disease progression in APL. The present study developed a novel droplet digital PCR (ddPCR) assay to rapidly detect two PML-RARα variants (bcr1 and bcr3) and compared its limit of detection (LOD) with quantitative PCR (qPCR). It was demonstrated that the LOD of ddPCR for PML-RARα reached 0.001%, and the evaluation of high copy number samples of PML-RARα by ddPCR correlated well with qPCR. Furthermore, clinical sample testing with ddPCR found that 34 and 24% samples were bcr-1-positive and bcr3-positive, respectively. However, according to qPCR, 30% of the samples were bcr1-positive and 20% were bcr3-positive. In addition, the concordance rate between ddPCR and qPCR reaction was 86%. While monitoring minimal residual disease, the PML-RARα mutation rate of three patients who recovered well decreased to 0.34%. However, one patient who was bcr3-positive and relapsed had a mutation rate of 13% while in remission, indicating that the bcr3 isoform may be an adverse prognostic factor affecting recovery. Therefore, the present results suggested that this novel ddPCR assay may be useful for monitoring and evaluating the treatment effects and prognosis of APL.

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