長熟チーズの細菌プロファイリングのための細胞外および細胞内DNA

Extracellular and intracellular DNA for bacterial profiling of long-ripened cheeses.

• Tommaso Bardelli
• Lia Rossetti
• Miriam Zago
• Domenico Carminati
• Giorgio Giraffa
• Flavio Tidona

抄録

細胞外DNA(eDNA)、すなわち微生物細胞外の遊離DNAを細胞内DNA(iDNA)と比較して抽出するための新しいアプローチを開発した。7種類の長熟チーズを用いて、2つのDNA画分を調査した。試験した異なる緩衝液の中で、pH8でのEDTA 0.5Mは、チーズサンプルのマイルドなホモジナイズと最高のeDNA回収を可能にした。抽出方法は、イタリアの長熟チーズの特徴であるストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）などの乳酸菌の単株を用いて試験した。この方法は、細胞溶解を最小限に抑え、細胞からの iDNA の流出を防ぐことができるため、eDNA 抽出に適した方法であることがわかった。0.01～0.36μg g-1 の範囲の eDNA の収率は、一般的に iDNA よりも高く、8～12 ヶ月の熟成後、無傷の細胞よりも自己分解現象が優勢であることが示された。7 種類のチーズのうち 4 種類では、長さ不均一性 PCR により eDNA と iDNA 分画から同じ LAB 種が検出されたが、残りの 3 種類のサンプルでは、対応する iDNA よりも eDNA の方が多くの種が強調されていた。eDNAとiDNAの逐次抽出は、長期熟成チーズの細菌群集の構成に関する追加情報を得るために適用することができる。

A novel approach was developed to extract the extracellular DNA (eDNA), i.e. the free DNA outside the microbial cell, compared to the intracellular DNA (iDNA). The two DNA fractions were investigated in seven long-ripened cheeses. Among different buffer solutions tested, EDTA 0.5 M at pH 8 enabled a mild homogenization of cheese samples and the highest eDNA recovery. The extraction protocol was tested on single strains of lactic acid bacteria characterizing many Italian long-ripened cheeses, such as Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus, and Lactobacillus rhamnosus. The method resulted suitable for eDNA extraction because it minimized cell-lysis, avoiding the leakage of iDNA from the cells. The yields of eDNA, ranging from 0.01 to 0.36 µg g-1 cheese, were generally higher than the iDNA, indicating that autolytic phenomena prevailed over intact cells after 8-12 months of ripening. In four of the seven cheeses, the same LAB species were detected in the eDNA and iDNA fractions by length-heterogeneity PCR, while in the remaining three samples, a higher number of species was highlighted in the eDNA compared to the corresponding iDNA. The sequential extraction of eDNA and iDNA can be applied to obtain additional information on the composition of the bacterial community in long-aged cheeses.

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