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ライゲーションと制限酵素に依存しないクローニング技術：インフルエンザ逆遺伝学システムにおけるハード・トゥ・クローン遺伝子セグメントのクローニングのための従来法への代替技術
A ligation and restriction enzyme independent cloning technique: an alternative to conventional methods for cloning hard-to-clone gene segments in the influenza reverse genetics system.
PMID: 32576218 PMCID: PMC7309217. DOI: 10.1186/s12985-020-01358-2.
抄録
背景:
逆遺伝学は、世界中の多くの研究室で使用されており、所望の遺伝子型または表現型を有するオーダーメイドのインフルエンザウイルスの作成を可能にする。しかし、このプロセスは完璧ではなく、逆遺伝学ベクター（pHW2000、pHH21、pCAGGS）へのインフルエンザ遺伝子セグメントのクローニング中には困難が残っています。逆遺伝学は、インフルエンザ遺伝子セグメントのcDNAコピーを作成し、それを双方向性プラスミド（pHW2000）または単方向性プラスミド（pHH21、pCAGGS）にクローニングした後、組換えプラスミドをHEK-293Tまたはトランスフェクションに寛容な他の適当な細胞にトランスフェクションすることから始まる。しかし、鳥インフルエンザウイルスの多くの現場で分離された遺伝子セグメントには内部制限部位が存在するため、従来の方法ではクローニングが困難であった。さらに、細菌中のインフルエンザ遺伝子含有プラスミド（特にポリメラーゼ基本２およびポリメラーゼ基本１遺伝子；ＰＢ２およびＰＢ１）の遺伝的不安定性は、細菌のゲノム配列を目的のインフルエンザ遺伝子に誤って組み込むことにもつながる。
BACKGROUND: Reverse genetics is used in many laboratories around the world and enables the creation of tailor-made influenza viruses with a desired genotype or phenotype. However, the process is not flawless, and difficulties remain during cloning of influenza gene segments into reverse genetics vectors (pHW2000, pHH21, pCAGGS). Reverse genetics begins with making cDNA copies of influenza gene segments and cloning them into bi-directional (pHW2000) or uni-directional plasmids (pHH21, pCAGGS) followed by transfection of the recombinant plasmid(s) to HEK-293 T or any other suitable cells which are permissive to transfection. However, the presence of internal restriction sites in the gene segments of many field isolates of avian influenza viruses makes the cloning process difficult, if employing conventional methods. Further, the genetic instability of influenza gene-containing plasmids in bacteria (especially Polymerase Basic 2 and Polymerase Basic 1 genes; PB2 and PB1) also leads to erroneous incorporation of bacterial genomic sequences into the influenza gene of interest.
方法:
ここでは、pHW2000ベクターにインフルエンザ遺伝子セグメントをクローニングするための簡単かつ効率的なライゲーションおよび制限酵素非依存性（LREI）クローニング法について報告する。この方法は、メガプライマーの増幅に続いて、ベイトプラスミドを用いたメガプライマーのPCR増幅、DpnI消化および形質転換を含む。
METHODS: Herein, we report an easy and efficient ligation and restriction enzyme independent (LREI) cloning method for cloning influenza gene segments into pHW2000 vector. The method involves amplification of megaprimers followed by PCR amplification of megaprimers using a bait plasmid, DpnI digestion and transformation.
結果:
難クローン遺伝子。A/鶏/バングラデシュ/23527/2014（H9N2）のPB2とPB1、A/鶏/江西/02.05YGYXG023-P/2015（H5N6）とA/鶏/ベトナム/H7F-14-BN4-315/2014（H9N2）のPB1を、当社のLREI法を用いてpHW2000にクローニングし、組換えウイルスを救出した。
RESULTS: Hard-to-clone genes: PB2 of A/chicken/Bangladesh/23527/2014 (H9N2) and PB1 of A/chicken/Bangladesh/23527/2014 (H9N2), A/chicken/Jiangxi/02.05YGYXG023-P/2015 (H5N6) and A/Chicken/Vietnam/H7F-14-BN4-315/2014 (H9N2) were cloned into pHW2000 using our LREI method and recombinant viruses were subsequently rescued.
結論:
LREIクローニング法は、逆遺伝学で使用される酵素のための内部制限部位を有するインフルエンザ遺伝子セグメントをクローニングするための代替戦略を表している。さらに、細菌の遺伝的不安定性の問題は、組換え細菌培養物を低温で培養することによって緩和されます。この技術は、ユニバーサルプライマーを用いたインフルエンザ遺伝子のクローニングにも応用可能であり、インフルエンザウイルスの迅速な作製、インフルエンザ研究やワクチン開発の促進に貢献しています。
CONCLUSION: The LREI cloning procedure represents an alternative strategy for cloning influenza gene segments which have internal restriction sites for the enzymes used in reverse genetics. Further, the problem of genetic instability in bacteria can be alleviated by growing recombinant bacterial cultures at a lower temperature. This technique can be applied to clone any influenza gene segment using universal primers, which would help in rapid generation of influenza viruses and facilitate influenza research and vaccine development.