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高悪性度軟部肉腫の統合的解析に基づくパゾパニブに対する反応予測バイオマーカーの評価。レスポンダーと他の軟部肉腫患者からの腫瘍サンプルの解析
Assessment of Predictive Biomarkers of the Response to Pazopanib Based on an Integrative Analysis of High-grade Soft-tissue Sarcomas: Analysis of a Tumor Sample from a Responder and Patients with Other Soft-tissue Sarcomas.
PMID: 32567826 DOI: 10.1097/CORR.0000000000001322.
抄録
背景:
軟部組織肉腫はまれな悪性腫瘍群であり，通常は外科的切除と放射線療法で治療されるが，最近では経口チロシンキナーゼ阻害薬であるパゾパニブが，標準的な化学療法レジメンに反応しない転移を有する患者に使用されるようになってきた。先行化学療法を受けた進行軟部肉腫患者を対象に、いくつかの臨床試験でパゾパニブで治療した軟部肉腫患者の生存率と感度（約5～10％の感度）が報告されています。近年、次世代シークエンシング（NGS）技術により、幅広い遺伝情報が得られ、がん治療における個別化医療の発展が期待されています。しかし、パゾパニブで完全奏効（CR）を示した軟部肉腫患者の報告はほとんどなく、遺伝子解析も行われていません。
BACKGROUND: Soft-tissue sarcomas are a rare group of malignant tumors that usually are treated with surgical excision and radiation therapy, but recently, pazopanib, an oral tyrosine kinase inhibitor, has been used in patients with metastases who do not respond to standard chemotherapy regimens. Based on patients with advanced soft-tissue sarcomas who had received prior chemotherapy, several clinical studies have reported the survival and sensitivity (approximately 5% to 10% sensitive) of patients with soft-tissue sarcomas treated with pazopanib. Recently, next-generation sequencing (NGS) technologies have been used to provide a wide genetic information and to develop personalized medicine in cancer treatment. However, there are few reports and no genetic analyses of patients with soft-tissue sarcomas who had a complete response (CR) to pazopanib.
質問／目的:
我々は、パゾパニブ治療でCRを達成した稀な進行性軟部肉腫患者の臨床病理学的特徴を報告した。さらに、NGSとアレイを用いた統合的解析を行い、パゾパニブに対する反応に関連する遺伝子変異、コピー数の変化、タンパク質発現などの特徴的な変化を明らかにした。さらに、同定された変異が発がん能力や薬物反応と関連しているかどうかを明らかにするために、in vitroおよびin vivoアッセイからなる機能解析を行った。
QUESTIONS/PURPOSES: We described the clinicopathologic features of a patient with a rare, advanced soft-tissue sarcoma who achieved a CR to pazopanib treatment. Furthermore, integrative analyses using NGS and arrays were performed to elucidate characteristic alterations, including gene mutations, copy number changes, and protein expression that were associated with response to pazopanib. Additionally, functional analyses consisting of in vitro and in vivo assays were also performed to elucidate whether the identified alterations were associated with oncogenic abilities and drug responses.
方法:
進行性軟部肉腫の70歳女性を対象に、パゾパニブ800mgを1日1回経口投与して1ヶ月間治療したところ、CTスキャンで治療に対するCRが確認された。我々の知る限り、パゾパニブの複数の臨床試験の中でCRを達成した軟部肉腫患者はおらず、この患者は極めて稀であると考えられる。我々は、CR を達成した患者の腫瘍サンプルを用いて、正常サンプルにマッチした CR 患者の腫瘍サンプルを用いて、全ゲノムシークエンシング、トランスクリプトームシークエンシング、受容体チロシンキナーゼ（RTK）のリン酸化プロファイリングを含む統合的な解析を行った。短期的な高悪性度部分奏効の方がより正確かもしれませんが、ここからはこの患者をCRと呼ぶことにします。これらの解析は、NGSおよびリン受容体チロシンキナーゼ（phospho-RTK）アレイを用いて行った。また、検証研究として、長期安定期の患者さん3例と、パゾパニブ治療が奏効した進行期の患者さん2例のサンプルを用いて、ターゲットシークエンシングを行いました。さらに、CR患者1例、長期安定病変患者3例、組織型が異なりパゾパニブに対する反応性が異なる高悪性度軟部肉腫患者27例において、パゾパニブに対する反応性に応じて同定された特徴的な遺伝子変化を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応により検証した。これらのゲノム変化の形質転換活性を評価するために焦点形成アッセイを行った。
METHODS: In a sample from a 70-year-old woman with an advanced soft-tissue sarcoma treated for 1 month with 800 mg of oral pazopanib daily, CT scans demonstrated a CR to treatment. To our knowledge, there have been no patients with soft-tissue sarcomas among several clinical trials of pazopanib that have achieved a CR and therefore, our patient is considered to be extremely rare. We performed an integrative analysis including whole-exome sequencing, transcriptome sequencing, and phosphorylation profiling of receptor tyrosine kinases (RTK) using tumor samples from a patient with a CR matched to normal samples. From here on we will refer to this patient as having a CR, although a short term high-grade partial response may be more accurate. These analyses were performed using NGS and the phosphoreceptor tyrosine kinase (phospho-RTK) array. As a validation study, we also performed target sequencing using three samples from patients with long-term stable disease and two samples from patients with progressive disease who responded to pazopanib treatment. In addition, characteristic gene alterations that were identified according to the response to pazopanib in one patient with a CR, in three patients with long-term stable disease, and in 27 patients with high-grade soft-tissue sarcomas with different histologic subtypes and different responses to pazopanib were verified by quantitative real-time polymerase chain reaction. We conducted a focus formation assay to evaluate the transforming activities of these genomic alterations.
結果:
パゾパニブに対するCRを有する患者において、Fms関連受容体チロシンキナーゼ1（FLT1）p.G38S、血小板由来成長因子受容体アルファ（PDGFRA）p.T83S、血小板由来成長因子受容体ベータ（PDGFRB）エキソン13スキップを含むいくつかの体細胞変異を同定した。GLIファミリージンクフィンガー1（GLI1）およびサイクリン依存性キナーゼ4（CDK4）を包含する染色体12q13-14での増幅も検出された。さらに、腫瘍内ではPDGFRBリン酸化レベルの上昇が観察された。5人の患者の標的配列解析では、長期安定病変の3人のうち1人に12q13-14の増幅が認められた。CR患者と高悪性度軟部肉腫患者27人のサンプルにおけるGLI1、CDK4、PDGFRA、PDGFRB、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）1-3、幹細胞因子受容体（KIT）を含むパゾパニブターゲットのmRNA発現を検証した。GLI1の発現は、他の軟部肉腫患者と比較して、CR患者および長期安定期の患者で特徴的に増加していた。GLI1の過剰発現は3T3細胞において強い形質転換能を示した。さらに、GLI1の過剰発現はPDGFRBタンパク質の発現を上昇させ、リン酸化を促進し、パゾパニブによって用量依存的に阻害された。しかし、パゾパニブによるGLI1誘導性形質転換の阻害は焦点形成試験では限定的であり、PDGFRB活性化以外の機序が形質転換に寄与している可能性があると考えられた。
RESULTS: In the patient with a CR to pazopanib, we identified several somatic mutations including Fms related receptor tyrosine kinase 1 (FLT1) p.G38S, platelet-derived growth factor receptor alpha (PDGFRA) p.T83S, and platelet-derived growth factor receptor beta (PDGFRB) exon 13 skipping. Amplification at chromosome 12q13-14 encompassing GLI family zinc finger 1 (GLI1) and cyclin-dependent kinase-4 (CDK4) was also detected. Furthermore, an elevated PDGFRB phosphorylation level was observed in the tumor. In target sequencing analyses in five patients, one of three patients with long-term stable disease had 12q13-14 amplification. The mRNA expression of GLI1, CDK4, and pazopanib targets including PDGFRA, PDGFRB, vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)1-3, and stem cell factor receptor (KIT) in samples from the patient with a CR, and 27 patients with high-grade soft-tissue sarcomas was verified. The expression of GLI1 was characteristically increased in the patient with a CR and in those with long-term stable disease relative to other patients with soft-tissue sarcomas. Overexpression of GLI1 showed strong transforming potential in 3T3 cells. Moreover, the overexpression of GLI1 upregulated the expression of the PDGFRB protein and promoted phosphorylation, which was dose-dependently inhibited by pazopanib. However, inhibition of GLI1-induced transformation by pazopanib was limited in the focus formation assay; therefore, mechanisms other than PDGFRB activation may contribute to transformation.
結論:
その結果、進行性軟部肉腫に対してパゾパニブを投与された患者において、CRや長期安定病変と関連していると考えられる遺伝子変化がいくつか確認された。したがって、このような特徴的な分子プロファイルは、パゾパニブに対する反応の予測バイオマーカーを同定するために、さらなる調査が必要であると考えられる。
CONCLUSIONS: We identified several gene alterations that might be associated with a CR and long-term stable disease in patients who received pazopanib for advanced soft-tissue sarcomas. We therefore believe that this distinct molecular profile warrants further investigation to identify predictive biomarkers of the response to pazopanib.
臨床応用:
我々の知見は、軟部肉腫のパゾパニブに対する感受性の高さを説明する分子メカニズムを明らかにし、軟部肉腫や他の軟部肉腫患者における予測バイオマーカーや新規治療法の開発につながる可能性がある。
CLINICAL RELEVANCE: Our findings identify molecular mechanisms that possibly explain the high sensitivity of soft-tissue sarcomas to pazopanib and may lead to the development of predictive biomarkers and novel therapies in patients with this and other types of soft-tissue sarcomas.