哺乳類分泌型組換え融合タンパク質rPCの構築・発現・精製

[Construction, expression and purification of a mammalian secretory recombinant fusion protein rPC].

• Chunchun Li
• Yuqiong Xie
• Jiang Cao
• Jimin Shao

抄録

がん治療には免疫チェックポイントを標的とした薬剤が用いられるが、単剤では抵抗性が生じる可能性がある。複数のチェックポイントを同時にブロックする併用療法は、臨床転帰を改善する可能性がある。そこで、我々は、プログラムされた細胞死タンパク質1（PD-1）と細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA-4）の細胞外ドメインからなる複数の標的をブロックする組換えタンパク質rPCを設計した。そのコーディング配列を発現ベクターに挿入し、HEK293細胞に安定的にトランスフェクトした。培養上清を回収し、rPCをアフィニティー精製した。リアルタイム定量PCRを用いて、いくつかのヒト癌細胞株におけるPD-1およびCTLA-4に対するリガンドの発現レベルを評価した。rPCと癌細胞との結合を免疫蛍光細胞染色で調べ、癌細胞の増殖に対するrPCの影響をCCK-8で測定した。その結果、rPCはHEK293細胞を安定的にトランスフェクトすることで発現・分泌され、精製されたrPCはPD-1やCTLA-4のリガンドを多く含む肺癌NCI-H226細胞に結合し、rPC処理による癌細胞増殖への直接的な影響は認められなかった。組換え蛋白質rPCは、がんに対する新規免疫治療薬の開発に向けて、さらに機能的にアッセイすることができます。

Drugs targeting immune checkpoint are used for cancer treatment, but resistance to single drug may occur. Combination therapy blocking multiple checkpoints simultaneously can improve clinical outcome. Therefore, we designed a recombinant protein rPC to block multiple targets, which consists of extracellular domains of programmed cell death protein 1 (PD-1) and cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4). The coding sequence was inserted into expression vector and stably transfected into HEK293 cells. The culture supernatant was collected and rPC was affinity-purified. Real-time quantitative PCR was used to evaluate the expression levels of ligands for PD-1 and CTLA-4 in several human cancer cell lines. The binding of rPC with cancer cells was examined by immunofluorescence cell staining, the influence of rPC on cancer cell growth was assayed by CCK-8. The results showed that rPC could be expressed and secreted by stably transfected HEK293 cells, the purified rPC could bind to lung cancer NCI-H226 cells which have high levels of ligands for PD-1 and CTLA-4, no direct impact on cancer cell growth could be observed by rPC treatment. The recombinant protein rPC can be functionally assayed further for developing novel immunotherapeutic drugs for cancer.

抑制性免疫检查点PD-1 或CTLA-4 靶向治疗药物已用于肿瘤的临床治疗，但单一靶点药物会有耐药发生，联合使用同时封闭多特殊靶点可提高疗效率，因此拟构建一个可封闭多个靶点的新型重蛋白组。首先设计并合成了一个由人类PD-1 和CTLA-4 两个受体的胞外功能域组成并且C 端带6His 标签的分泌型重组融合蛋白rPC 编码序列，入插真核细胞表达载体LVX-IRES-ZsGreen1，稳定转染HEK293.胞，收集细胞培养上清，以亲和方法纯化重组蛋白rPC，通过实时荧光定量PCR 检测多个人类肿瘤细胞系中PD-1 配体PD-L1、PD-L2 和CTLA-4配体CD80、CD86 的表达，以选择相对高表达的细胞，利用细胞免疫荧光染色方法检验rPC 与肿瘤细胞的结合能力，并用CCK-8 法检测rPC 是否对肿瘤细胞的生长有影响。结果表明，重组融合蛋白質PC 可由稳定转染表达载体的HEK293 细胞表达并分泌，纯化后的rPC 可以与PD-1 和CTLA-4 配体表达相对较高的肺癌细胞NCI-H226结合，并且rPC 处理对其生长并无直接影响，与预期一致。成功获得的重融合蛋白组rPC 可用于进一步的体内外功能研究，也为今后研发新型多靶点肿瘤免疫治疗蛋白药物打下了坚实的基础。

抑制性免疫检查点PD-1 或CTLA-4 靶向治疗药物已用于肿瘤的临床治疗，但单一靶点药物会有耐药发生，联合使用同时封闭多个靶点可提高疗效，因此拟构建一个可封闭多个靶点的新型重组蛋白。首先设计并合成了一个由人类PD-1 和CTLA-4 两个受体的胞外功能域组成并且C 端带6His 标签的分泌型重组融合蛋白rPC 编码序列，插入真核细胞表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1，稳定转染HEK293 细胞，收集细胞培养上清，以亲和方法纯化重组蛋白rPC，通过实时荧光定量PCR 检测多个人类肿瘤细胞系中PD-1 配体PD-L1、PD-L2 和CTLA-4配体CD80、CD86 的表达，以选择相对高表达的细胞，利用细胞免疫荧光染色方法检验rPC 与肿瘤细胞的结合能力，并用CCK-8 法检测rPC 是否对肿瘤细胞的生长有影响。结果表明，重组融合蛋白rPC 可由稳定转染表达载体的HEK293 细胞表达并分泌，纯化后的rPC 可以与PD-1 和CTLA-4 配体表达相对较高的肺癌细胞NCI-H226结合，并且rPC 处理对其生长并无直接影响，与预期一致。成功获得的重组融合蛋白rPC 可用于进一步的体内外功能研究，也为今后研发新型多靶点肿瘤免疫治疗蛋白药物打下了坚实的基础。.