2つの密接に関連した細菌P450樟脳モノオキシゲナーゼ間の予想外の違い

Unexpected Differences between Two Closely Related Bacterial P450 Camphor Monooxygenases.

• Vidhi C Murarka
• Dipanwita Batabyal
• Jose A Amaya
• Irina F Sevrioukova
• Thomas L Poulos

抄録

細菌性チトクロムP450camは、炭素/エネルギー源としての樟脳の酸化的同化の第一段階として、樟脳の酸化を5--ヒドロキシカンファーに触媒する。ＣＹＰ１０１Ｄ１は、同じ反応を触媒する別の細菌Ｐ４５０である。第三のP450（P450tcu）は、P450camと同様に非常に類似した酵素特性と同様に≈86％の配列同一性を有することが最近発見された。しかし、P450tcuはP450camには見られない3つの特異な特徴を持っています。このことは、P450camの場合とは異なり、X線で生成された還元性等価物が基質の水酸化を促進することを示唆しています。分子動力学シミュレーションに基づいて、P450tcuの柔軟性の向上により、活性部位へのプロトンのアクセスが容易になり、X線駆動還元と相まって、Oの活性化と基質の水酸化反応が起こると仮定した。第二に、カンファーが結合する際の特徴的な低スピンから高スピンへの転移は、P450camではすぐに起こるが、P450tcuでは非常に遅い。第三に、等温滴定熱量測定により、P450camではΔが0以上で基質結合がエントロピー的に駆動されるのに対し、P450tcuではΔが0未満で-Δがより緩やかに変化することが示された。これらの結果は、ほぼ同一の構造と酵素特性にもかかわらず、これら2つのP450が全く異なる特性を示していることを示しています。

The bacterial cytochrome P450cam catalyzes the oxidation of camphor to 5--hydroxycamphor as the first step in the oxidative assimilation of camphor as a carbon/energy source. CYP101D1 is another bacterial P450 that catalyzes the same reaction. A third P450 (P450tcu) has recently been discovered that has ≈86% sequence identity to P450cam as well as very similar enzymatic properties. P450tcu, however, exhibits three unusual features not found in P450cam. First, we observe product in at least two orientations in the X-ray structure that indicates that, unlike the case for P450cam, X-ray-generated reducing equivalents can drive substrate hydroxylation . We postulate, on the basis of molecular dynamics simulations, that greater flexibility in P450tcu enables easier access of protons to the active site and, together with X-ray driven reduction, results in O activation and substrate hydroxylation. Second, the characteristic low-spin to high-spin transition when camphor binds occurs immediately with P450cam but is very slow in P450tcu. Third, isothermal titration calorimetry shows that in P450cam substrate binding is entropically driven with a Δ of >0 while in P450tcu with a Δ of <0 with a more modest change in -Δ. These results indicate that despite nearly identical structures and enzymatic properties, these two P450s exhibit quite different properties most likely related to differences in conformational dynamics.