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色素上皮由来の新規ナチュラルキラー細胞由来因子である色素上皮由来因子は、妊娠初期に抗炎症と抗アポトーシスを介して間質細胞を保護する
Pigment epithelium-derived factor, a novel decidual natural killer cells-derived factor, protects decidual stromal cells via anti-inflammation and anti-apoptosis in early pregnancy.
PMID: 32544239 DOI: 10.1093/humrep/deaa118.
抄録
研究の質問:
妊娠初期におけるdNK細胞由来の色素上皮由来因子（PEDF）の役割とは？
STUDY QUESTION: What is the role of pigment epithelium-derived factor (PEDF) from decidual natural killer (dNK) cells during early pregnancy?
サマリー・アンサー:
dNK細胞からのPEDFは、妊娠初期の間に母体と胎児の界面でDSCsのホメオスタシスと免疫バランスを維持するために、リポ多糖類（LPS）誘発アポトーシスとdecidual stromal細胞（DSCs）の炎症を制限します。
SUMMARY ANSWER: PEDF from dNK cells limits the lipopolysaccharide (LPS)-induced apoptosis and inflammation of decidual stromal cells (DSCs) to maintain DSCs homoeostasis and immune balance at the maternal-foetal interface during early pregnancy.
すでに知られていること:
PEDFを分泌するdNK細胞は、一連の重要な調節因子を介して妊娠中に重要な役割を果たします。多機能性内因性糖タンパク質であるPEDFは、血管新生、炎症、代謝ホメオスタシス、免疫調節などに幅広い生物学的作用を示し、臨床応用の可能性を秘めています。
WHAT IS KNOWN ALREADY: dNK cells, which secrete PEDF, play critical roles during pregnancy via a series of key regulators. PEDF, a multifunctional endogenous glycoprotein, exhibits a wide range of biological actions upon angiogenesis, inflammation, metabolic homoeostasis, immunomodulation etc., providing potential clinical applications.
デザイン、サイズ、期間:
妊娠初期（6～10週）の正常妊娠（NP）から分離されたDSCと再発流産（RM）患者を対象に、デシジュアと末梢血からのナチュラルキラー（NK）細胞を調査した。dNK細胞のRNAシーケンス解析を行い、流産に関与する潜在的な主要遺伝子をスクリーニングした。また、dNK細胞におけるPEDFの発現を調べた。また，LPS 刺激を受けた DSC と NP または RM 由来の NK 細胞上清を用いた共培養系を構築し，母体と胎児の界面における PEDF の制御機構を探った．
STUDY DESIGN, SIZE, DURATION: Natural killer (NK) cells from decidua and peripheral blood as well as DSCs isolated from normal pregnancy (NP) during the first trimester (6-10 weeks) and the matched patients suffering recurrent miscarriage (RM) were studied. RNA-sequencing analysis of dNK cells was performed to screen for potential key genes involved in RM. The expression of PEDF in dNK cells in NP and RM was examined. A coculture system with LPS-stimulated DSCs and NK cell supernatants derived from NP or RM was established to explore the regulatory mechanisms of PEDF at the maternal-foetal interface.
参加者/材料、設定、方法:
NP（n=61）とRM（n=21）の女性から末梢血と落葉組織を採取した。フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、免疫組織化学を用いて、NK細胞におけるPEDFとその受容体（PEDFR）のDSC上での発現レベルを分析した。精製した末梢ナチュラルキラー(pNK)細胞をDSCまたはトロフォブラスト細胞、または両方の細胞タイプの組み合わせで共培養し、pNK細胞におけるPEDFの発現をフローサイトメトリーで調べた。DSCをグラム陰性菌の膜外成分であるLPSで処理し、デシデュア内の炎症状態の亢進を模倣し、NPまたはRMからのdNK細胞上清を用いて共培養した。共培養系では、短いヘアピンRNAを発現するプラスミドを用いて、DSC上のPEDFRを沈黙させ、PEDF/PEDFR相互作用をブロックした。上記のように処理したＤＳＣの炎症性サイトカインおよびアポトーシスをフローサイトメトリーで評価した。ウェスタンブロットを行い、特異的シグナル経路阻害剤を用いて、初期デシジュアにおける下流のPEDF/PEDFRシグナル伝達を決定した。
PARTICIPANTS/MATERIALS, SETTING, METHODS: Peripheral blood and decidual tissues were obtained from women with NP (n = 61) and RM (n = 21). The expression levels of PEDF in NK cells and its receptor (PEDFR) on DSCs were analysed using flow cytometry, western blot and immunohistochemistry. Purified peripheral natural killer (pNK) cells were cocultured with DSCs or trophoblast cells or a combination of both cell types, and PEDF expression in pNK cells was then examined by flow cytometry. DSCs were treated with LPS, an outer-membrane component of Gram-negative bacteria, thereby mimicking an enhanced inflammatory status within decidua, and were cocultured with dNK cell supernatants from NP or RM. In the coculture system, plasmids expressing short hairpin RNA were used to silence PEDFR on DSCs and block the PEDF/PEDFR interaction. Inflammatory cytokines and apoptosis of DSCs treated as described above were assessed by flow cytometry. Western blotting was performed, and the specific signal pathway inhibitors were used to determine downstream PEDF/PEDFR signalling in early decidua.
主な結果とチャンスの役割:
正常dNK細胞では、pNK細胞と比較して、PEDFのRNA（P<0.001）およびタンパク質（P<0.01）の発現が有意に高かった。単独培養したpNK細胞と比較して、DSC(P<0.01)またはtrophoblast細胞(P<0.001)との共培養後にpNK細胞のPEDF発現が上昇した。LPS刺激後のDSCsのプロ炎症性サイトカイン、腫瘍壊死因子αおよびアポトーシスの増加は、組換えヒトPEDF(P<0.001)またはNP由来のdNK細胞の上清(P<0.001)によって抑制された。しかし、これらの効果は、PEDF/PEDFR相互作用をPEDFR short hairpin sRNAでブロックした場合には幾分阻害された(P<0.01)。さらに、dNK細胞由来のPEDFは、核内因子κBの活性化を阻害することでLPS誘発性炎症からDSCを保護し、細胞外シグナル制御キナーゼ発現を促進することでLPS誘発性アポトーシスからDSCを保護した。女性RM患者では、NPと比較して、dNK細胞ではPEDF RNA（P<0.001）とタンパク質発現（P<0.001）が有意に減少したが、pNK細胞では減少しなかった（P>0.05）ことが明らかになった。また、DSC上のPEDFRもRMではNPに比べて減少していた（P<0.001）。その結果、LPS処理したDSCの保護のためのdNK細胞による抗炎症（P<0.01）および抗アポトーシス（P<0.05）はRM患者では減少した。
MAIN RESULTS AND THE ROLE OF CHANCE: Markedly higher RNA (P < 0.001) and protein expression of PEDF (P < 0.01) was detected in normal dNK cells when compared with pNK cells. Compared with pNK cells cultured alone, PEDF expression in pNK cells was elevated after coculture with DSCs (P < 0.01) or trophoblast cells (P < 0.001). The increased pro-inflammatory cytokine, tumour necrosis factor-α and apoptosis of DSCs following LPS stimulation were suppressed by recombinant human PEDF (P < 0.001) or the supernatant of dNK cells derived from NP (P < 0.001). However, these effects were somewhat abrogated when the PEDF/PEDFR interaction was blocked with PEDFR short hairpin sRNA (P < 0.01). Furthermore, dNK cell-derived PEDF protected DSCs from LPS-induced inflammation via inhibition of nuclear factor kappa-B activation, while also protecting DSCs from LPS-induced apoptosis via promotion of extracellular signal-regulated kinase expression. Compared with NP, both significantly decreased PEDF RNA (P < 0.001) and protein expression (P < 0.001) in dNK cells, but not in pNK cells (P > 0.05), were detected in women with RM. PEDFR on DSCs was also decreased within RM compared with that within NP (P < 0.001). As a result, dNK cell-mediated anti-inflammation (P < 0.01) and anti-apoptosis (P < 0.05) for protection of LPS-treated DSCs was attenuated in patients suffering from RM.
大規模データ:
N/Aです。
LARGE SCALE DATA: N/A.
制限、注意の理由:
我々は、NP女性とRM女性の組織におけるPEDFとその受容体の量の違いが、RM女性の流産イベントに起因する可能性を排除することはできません。我々の実験は、in vitroで調査されたヒトサンプルのみを対象としている。これらの知見を確認し、NPおよび/またはRMにおけるPEDF-PEDFRの役割をさらに明らかにするためには、動物モデルやヒトの研究コホートでの実験が必要である。
LIMITATIONS, REASONS FOR CAUTION: We cannot exclude the possibility that the differences in amounts of PEDF and its receptor in tissue from NP versus RM women could be caused by the miscarriage event in women with RM. Our experiments only involved human samples investigated in vitro. Experiments in animal models and human study cohorts are still needed to confirm these findings and further clarify the role of PEDF-PEDFR in NP and/or RM.
本研究成果の広い意味での応用:
我々の知る限りでは、本研究は、第一期の母体-胎児界面でのPEDFの発現と機能を実証する最初の研究であり、PEDFは機能的な多様性を示し、臨床応用のための大きな可能性を持っていることをさらに証明しています（s）。正常なdNK細胞でPEDFが選択的に高発現していることや、NPとRMの間にdNK細胞がPEDFを介して役割を果たしていることが明らかになったことは、RMの背後にある免疫機構のさらなる解明に役立つものと思われます。
WIDER IMPLICATIONS OF THE FINDINGS: To the best of our knowledge, this is the first study to demonstrate PEDF expression and function at the maternal-foetal interface in the first trimester, providing further evidence that PEDF exhibits functional diversity and has great potential for clinical application(s). The findings of selectively high expression of PEDF in normal dNK cells and the PEDF-mediated role of dNK cells during NP and RM help to further elucidate the immune mechanisms behind RM.
研究資金/共同研究の関心事:
本研究は、中国国家基礎研究計画（2017YFC1001403、2015CB943300）、中国国立自然科学財団からの支援を受けた（NSFC.31970859、81630036、81501334、91542116、31570920、81490744、31171437）、NHC生殖規制重点研究室からのイノベーション志向科学技術助成金（CX2017-2）、上海学術/技術研究リーダープログラム（17XD1400900）、上海市科学技術委員会からの上海基礎研究重点プロジェクト（STCSM; 12JC1401600）の支援を受けている。著者はいずれも申告すべき利益相反がない。
STUDY FUNDING/COMPETING INTEREST(S): This work was supported by the National Basic Research Programme of China (2017YFC1001403 and 2015CB943300), Nature Science Foundation from National Nature Science Foundation of China (NSFC; 31970859, 81630036, 81501334, 91542116, 31570920, 81490744 and 31171437), the Innovation-oriented Science and Technology Grant from NHC Key Laboratory of Reproduction Regulation (CX2017-2), the Programme of Shanghai Academic/Technology Research Leader (17XD1400900) and the Key Project of Shanghai Basic Research from Shanghai Municipal Science and Technology Commission (STCSM; 12JC1401600). None of the authors has any conflict of interest to declare.
© The Author(s) 2020. Published by Oxford University Press on behalf of European Society of Human Reproduction and Embryology. All rights reserved. For permissions, please email: journals.permissions@oup.com.