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抗菌ペプチドを発現させた単細胞緑藻Haematococcus pluvialisの葉緑体遺伝子工学的研究
Chloroplast Genetic Engineering of a Unicellular Green Alga Haematococcus pluvialis with Expression of an Antimicrobial Peptide.
PMID: 32535692 DOI: 10.1007/s10126-020-09978-z.
抄録
本研究の目的は、H. pluvialisのプラスチッド工学をさらに発展させるために、葉緑体で抗菌ペプチドを発現させることであった。16S-trnI/trnA-23S領域と、H. pluvialisにおけるpsbAプロモーター、rbcLプロモーター、rbcLターミネーター、psbAターミネーターを含む4つの内因性調節エレメントの相同的ターゲティングを行い、H. pluvialisの葉緑体形質転換ベクターを構築した。H. pluvialis の葉緑体におけるコドン最適化抗菌ペプチド piscidin-4 遺伝子（ant1）と選択マーカー遺伝子（bar、ビオラホス耐性遺伝子）の発現は、それぞれ rbcL プロモーターと psbA プロモーターによって制御されていた。生物学的形質転換を行い、ホスフィノトリシンで選択した後、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、サザンブロッティング、ウエスタンブロッティングを用いて、葉緑体ゲノム中のant1の集積と発現を検出した。この方法を用いて、H. pluvialis に抗菌ペプチド piscidin-4 を発現させることに成功した。以上の結果から、H. pluvialisは、バイオテクノロジーへの応用を目的とした組換えタンパク質の発現プラットフォームとして期待されており、今後の遺伝子工学的改良の促進にも貢献するものと考えられる。
The purpose of this study was to express an antimicrobial peptide in the chloroplast to further develop the plastid engineering of H. pluvialis. Homologous targeting of the 16S-trnI/trnA-23S region and four endogenous regulatory elements, including the psbA promoter, rbcL promoter, rbcL terminator, and psbA terminator in H. pluvialis, were performed to construct a chloroplast transformation vector for H. pluvialis. The expression of codon-optimized antimicrobial peptide piscidin-4 gene (ant1) and selection marker gene (bar, biolaphos resistance gene) in the chloroplast of H. pluvialis was controlled by the rbcL promoter and psbA promoter, respectively. Upon biolistic transformation and selection with phosphinothricin, integration and expression of ant1 in the chloroplast genome were detected using polymerase chain reaction (PCR), southern blotting, and western blotting. Using this method, we successfully expressed antimicrobial peptide piscidin-4 in H. pluvialis. Hence, our results showed H. pluvialis promises as a platform for expressing recombinant proteins for biotechnological applications, which will further contribute to promoting genetic engineering improvement of this strain.