ゲルろ過クロマトグラフィーを用いたフリーフロー電気泳動による卵白中の低容量リゾチームの精製

Purification of low-abundance lysozyme in egg white via free-flow electrophoresis with gel-filtration chromatography.

• Shuang Dong
• Ziqin Jiang
• Zhen Liu
• Ling Chen
• Qiang Zhang
• Youli Tian
• Amir Sohail
• Muhammad Idrees Khan
• Hua Xiao
• Xiaoping Liu
• Yuxing Wang
• Honggen Li
• Hanyu Wu
• Weiwen Liu
• Chengxi Cao

抄録

フリーフロー電気泳動は、有効な分離手段として、これまで複雑な試料マトリックス中の低濃度タンパク質の精製には利用されていなかった。ここでは、ゲルフィルトレーションクロマトグラフィー（GFC）と結合したFFEによる低含有ペプチドの精製を実証するためのモデルタンパク質として、卵白複合体マトリックス中のリゾチームを選択した。卵白中の粗リゾチームは、最初にフリーフローゾーン電気泳動（FFZE）で分離した。その後、凍結乾燥によりリゾチーム活性を有する画分を濃縮した。その後、凝縮画分をSephadex G50のGFCを介してさらに精製した。全ての実験において、リゾチームの同定には、特殊なポリ（アクリルアミド-アクリル酸）（P(AM-co-AA)）ゲル電気泳動と質量分析を用いた。FFZEの条件は以下のように最適化した。130μL/minのサンプル流量、20mM pH 5.5 Tris-酢酸のバックグラウンドバッファー4.9mL/min、350V、14℃で、粗サンプルのタンパク質含有量2mg/mLとした。その結果、精製リゾチームの純度は80%であり、活性は検出不可能であったが、粗サンプルの含有量は1.4%であり、活性は検出不可能であった。第一分離ステップでの回収率は65％、第二分離ステップでの回収率は82％であり、合計回収率は約53.3％であった。回収率が低い理由としては、P(AM-co-AA)ゲルからリゾチームが拡散したことや、高濃度の卵黄アルブミンが一緒に除去されたことが考えられた。これらの結果から、FFEは低回収率の溶質を精製するための代替手段として利用できる可能性があることが示唆された。

As an effective separation tool, free-flow electrophoresis has not been used for purification of low-abundance protein in complex sample matrix. Herein, lysozyme in complex egg white matrix was chosen as the model protein for demonstrating the purification of low-content peptide via an FFE coupled with gel fitration chromatography (GFC). The crude lysozyme in egg while was first separated via free-flow zone electrophoresis (FFZE). After that, the fractions with lysozyme activity were condensed via lyophilization. Thereafter, the condensed fractions were further purified via a GFC of Sephadex G50. In all of the experiments, a special poly(acrylamide- co-acrylic acid) (P(AM-co-AA)) gel electrophoresis and a mass spectrometry were used for identification of lysozyme. The conditions of FFZE were optimized as follows: 130 μL/min sample flow rate, 4.9 mL/min background buffer of 20 mM pH 5.5 Tris-Acetic acid, 350 V, and 14 °C as well as 2 mg/mL protein content of crude sample. It was found that the purified lysozyme had the purity of 80% and high activity as compared with its crude sample with only 1.4% content and undetectable activity. The recoveries in the first and second separative steps were 65% and 82%, respectively, and the total recovery was about 53.3%. The reasons of low recovery might be induced by diffusion of lysozyme out off P(AM-co-AA) gel and co-removing of high-abundance egg ovalbumin. All these results indicated FFE could be used as alternative tool for purification of target solute with low abundance.

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