ヘショウウインが精子形成細胞のアポトーシスにおけるCyt c/Apaf-1/Caspase-9/Caspase-3経路を阻害するメカニズム

Mechanism of Heshouwuyin inhibiting the Cyt c/Apaf-1/Caspase-9/Caspase-3 pathway in spermatogenic cell apoptosis.

• Hongjie Wang
• Juan Zhu
• Liping Jiang
• Boying Shan
• Peihan Xiao
• Jiayi Ai
• Na Li
• Feng Qi
• Siyun Niu

抄録

背景:

漢方化合物ヘショウウインは、Wistar自然老化ラットの精巣組織細胞のアポトーシス率をダウンレギュレートすることが示されており、この効果はミトコンドリア経路に関連している可能性があります[15]。アポトーシスプロテアーゼ活性化因子-1（Apaf-1）は、ミトコンドリア内因性アポトーシス経路の主要な要素であるアポトーシス複合体の主要な構成要素である[13]。本研究では、ミトコンドリア内因性アポトーシス経路におけるヘショウウインのメカニズムをさらに明らかにするために、Apaf-1を標的として、ヘショウウインが精子細胞のアポトーシスのApaf-1経路を阻害するメカニズムを探った。

BACKGROUND: The Chinese herbal compound Heshouwuyin has been shown to downregulate the apoptotic rate of testicular tissue cells in Wistar naturally aging rats, and this effect might be related to the mitochondrial pathway [15]. Apoptotic protease activating factor-1 (Apaf-1) is a major component of the apoptotic complex, which is a key element of the mitochondrial endogenous apoptotic pathway [13]. To further clarify the mechanism of Heshouwuyin in the mitochondrial apoptotic pathway, this study used Apaf-1 as a target to explore the mechanism by which Heshouwuyin inhibits the Apaf-1 pathway of spermatogenic cell apoptosis.

方法:

本研究では、フリーラジカル酸化損傷を用いてラット精子細胞の老化モデルを確立した。生殖細胞のアポトーシス率とヘショウブインの抑制効果をフローサイトメトリーで検出した。また、精子形成細胞のミトコンドリアアポトーシス経路における主要遺伝子であるCyt c、Caspase-9、Caspase-3の発現をqRT-PCR、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光分析により検出した。

METHODS: In this study, an aging model of rat spermatogenic cells was established using free radical oxidative damage. Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of germ cells and the inhibitory effect of Heshouwuyin. Apaf-1 was specifically knocked down by siRNA interference technology, and mitochondrial membrane potential was measured. qRT-PCR, Western blotting and immunofluorescence analyses were used to detect the expression of the key genes Cyt c, Caspase-9 and Caspase-3 in the mitochondrial apoptotic pathway of spermatogenic cells.

結果:

Heshouwuyinは、有精子化細胞において、Cyt c、Caspase-9およびCaspase-3のmRNAおよびタンパク質発現レベルを低下させた。これらの細胞では、Apaf-1を特異的にノックダウンしても、Cyt cのmRNAおよびタンパク質発現量は有意に変化せず、Caspase-9およびCaspase-3のmRNAおよびタンパク質発現量は有意に減少した。このことから、Apaf-1 のノックダウンは、下流のアポトーシス遺伝子である Caspase-9 および Caspase-3 の mRNA およびタンパク質発現レベルを低下させる可能性があることが示唆された。Cyt c は Apaf-1 の上流遺伝子であるが、Apaf-1 のノックダウンは Cyt c 発現に有意な影響を与えなかった。

RESULTS: Heshouwuyin reduced the mRNA and protein expression levels of Cyt c, Caspase-9 and Caspase-3 in senescent spermatogenic cells. In these cells, the mRNA and protein expression levels of Cyt c did not change significantly after specific knockdown of Apaf-1, and the mRNA and protein expression levels of Caspase-9 and Caspase-3 decreased significantly. This finding indicated that knockdown of Apaf-1 could decrease the mRNA and protein expression levels of the downstream pro-apoptotic genes Caspase-9 and Caspase-3. Although Cyt c was an upstream gene of Apaf-1, knockdown of Apaf-1 had no significant effect on Cyt c expression.

結論:

ヘショウブインによる造精細胞のアポトーシス阻害は、Cyt c/Apaf-1/Caspase-9/Caspase-3経路と密接に関連していた。ヘショウウインによるアポトーシスの阻害は、Apaf-1経路だけでなく、他のシグナル伝達経路にも関与していた。

CONCLUSION: The inhibition of spermatogenic cell apoptosis by Heshouwuyin was closely related to the Cyt c/Apaf-1/Caspase-9/Caspase-3 pathway. The inhibition of apoptosis by Heshouwuyin not only involved the Apaf-1 pathway, but other signaling pathways.