生化学的・構造解析のための哺乳類細胞からの組換え膜タンパク質の作製

Production of Recombinant Transmembrane Proteins from Mammalian Cells for Biochemical and Structural Analyses.

• Robbins Puthenveetil
• Chul-Jin Lee
• Anirban Banerjee

抄録

真核生物の膜タンパク質は、様々な生物学的プロセスの鍵を握っています。膜タンパク質は様々な疾患に関与しているため、その構造と機能を解明し、作用機序を理解することが重要である。そのためには、膜タンパク質の構造と機能を解明することが重要であるが、組換え膜タンパク質の作製に伴う複雑な技術的課題があり、構造生化学的手法を用いた理解は困難である。本研究では、バキュロウイルスを導入したHEK293S GnTi細胞を用いた真核生物膜タンパク質の大規模異種発現・精製法の開発を行っています。本研究では、ヒトの膜タンパク質であるhDHHC15とhPORCNを例として、バキュロウイルスを用いたトランスフェクションとその生成、HEK293S GnTi細胞からの過剰発現と精製の手順を紹介します。基本プロトコール１：哺乳類HEK293T細胞における小規模なタンパク質発現 基本プロトコール２：Sf9（昆虫）細胞からのバキュロウイルスの生成 代替プロトコール。Pウイルスストックの無菌化法 サポートプロトコル１：HEK293T細胞のPバキュロウイルスによる小規模導入 基本プロトコル３：HEK293S GnTi細胞の大規模ウイルス導入 サポートプロトコル２：HEK293S GnTi細胞からの大規模膜作製 基本プロトコル４：HEK293S GnTi細胞からの膜タンパク質の大規模精製

Eukaryotic integral membrane proteins are key components of various biological processes. Because they are implicated in multiple diseases, it is important to understand their mechanism of action by elucidating their structure and function. Complex technical challenges associated with the generation of recombinant membrane proteins severely impair our ability to understand them using structural and biochemical methods. Here, we provide a detailed procedure to address and mitigate difficulties involved in the large-scale heterologous overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins using HEK293S GnTi cells transduced with baculovirus. Two human proteins, hDHHC15 and hPORCN, are presented as examples, with step-by-step instructions for transient transfection and generation of baculoviruses, followed by overexpression and purification from HEK293S GnTi cells. © 2020 Wiley Periodicals LLC. Basic Protocol 1: Small-scale protein expression in mammalian HEK293T cells Basic Protocol 2: Generation of baculovirus from Sf9 (insect) cells Alternate Protocol: Enumeration-free method for generating P viral stock Support Protocol 1: Small-scale transduction of HEK293T cells with P baculovirus Basic Protocol 3: Large-scale viral transduction of HEK293S GnTi cells Support Protocol 2: Large-scale membrane preparation from HEK293S GnTi cells Basic Protocol 4: Large-scale purification of membrane proteins from HEK293S GnTi cells.

Published 2020. This article is a US Government work and is in the public domain in the USA.