バクテリオファージ誘導溶解と画像解析を用いた大腸菌の迅速検出

Rapid detection of Escherichia coli using bacteriophage-induced lysis and image analysis.

• Xu Yang
• Nicharee Wisuthiphaet
• Glenn M Young
• Nitin Nitin

抄録

細菌性病原体の迅速な検出は、灌漑用水などの食品および環境サンプルの両方において、重要なアンメットニーズとなっています。食品安全性近代化法（FSMA）の一環として、農産物安全規則では、水中の汎用大腸菌の存在を検査するためのいくつかの要件が定められているが、現在利用可能な検査方法（EPA M1603）では、これらの検査を実施するために、指定された複数のコロニーの検証と高度な訓練を受けた担当者が必要とされている。本研究の目的は、8時間以内に低濃度の大腸菌を迅速に検出するために、定量的画像分析を用いたファージ誘導細菌溶解法を評価することであった。本研究は、複雑なマトリックス中の標的細菌を検出するためのシンプルでありながら高感度かつ特異的なアプローチを開発することを目的とした。本研究では、まず大腸菌細胞をトリプティック大豆ブロス（TSB）中に濃縮し、次いでT7ファージ誘導溶解、濃縮、染色、蛍光イメージングを行った。画像の前処理、画像のセグメンテーション、細胞の形態学的特徴（面積、偏心度、半値最大時の全幅）の定量的な解析を含む画像解析を行った。生鮮食品の洗浄水、ココナッツ水、ほうれん草の洗浄水を模擬した現実的なマトリクスを用いたチャレンジ実験により、食品加工現場での応用が可能であることを実証した。その結果、T7ファージで溶解された大腸菌細胞は、細胞外へのDNA放出が有意に高く（P < 0.05）、細胞形状の変化（棒状から円形へ）、蛍光シグナルの拡散強度が高いことが示された。このバイオセンシング戦略を用いて、実験室の培地および複雑なマトリックス中で、8時間以内に10 CFU/mlの大腸菌を検出する感度を達成した。提案されたファージベースのバイオセンシング戦略は、細菌の迅速な検出を可能にし、食品システムの分析に適用可能である。さらに、このアッセイに関与するステップは自動化され、大規模なリソースを必要とせずに食品施設での標的細菌の検出を可能にすることができます。

Rapid detection of bacterial pathogens is a critical unmet need for both food and environmental samples such as irrigation water. As a part of the Food safety Modernization Act (FSMA), The Produce Safety rule has established several requirements for testing for the presence of generic Escherichia coli in water, but the current method available for testing (EPA M1603) demands specified multiple colony verification and highly trained personnel to perform these tests. The purpose of the study was to assess a phage induced bacterial lysis using quantitative image analysis to achieve rapid detection of E. coli at low concentrations within 8 hours. This study aimed to develop a simple yet highly sensitive and specific approach to detect target bacteria in complex matrices. In the study, E. coli cells were first enriched in tryptic soy broth (TSB), followed by T7 phage induced lysis, concentration, staining and fluorescent imaging. Image analysis was conducted including image pre-processing, image segmentation and quantitatively analysis of cellular morphological features (area, eccentricity and full width at half maximum). Challenge experiments using realistic matrices, including simulated fresh produce wash water, coconut water and spinach wash water, demonstrated the method can be applied for use in situations that occur in food processing facilities. The results indicated E. coli cells that are lysed by T7 phages demonstrated significantly (P < 0.05) higher extracellular DNA release, altered cellular shape (from rod to circular) and diffused fluorescent signal intensity. Using this biosensing strategy, a sensitivity to detect Escherichia coli at 10 CFU/ml within 8 hours was achieved, both in laboratory medium and in complex matrices. The proposed phage based biosensing strategy enables rapid detection of bacteria and is applicable to analysis of food systems. Furthermore, the steps involved in this assay can be automated to enable detection of target bacteria in food facilities without extensive resources.