クラウンエーテルを介在させた米国産の糖転移酵素PaGT3の結晶構造

Crown-ether-mediated crystal structures of the glycosyltransferase PaGT3 from Phytolacca americana.

• Rakesh Maharjan
• Yohta Fukuda
• Taisuke Nakayama
• Toru Nakayama
• Hiroki Hamada
• Shin Ichi Ozaki
• Tsuyoshi Inoue

抄録

ウリジン二リン酸糖転移酵素（UGT）は、低分子のグリコシル化に関与するユビキタス酵素である。グリコシル化により疎水性化合物の水溶性や安定性が向上することから、水溶性の悪い化合物のグリコシド合成にUGTを利用することへの関心が高まっている。UGTsにおける糖供与体認識は、植物二次産物糖転移酵素（PSPG）モチーフの存在により保存されているが、アクセプター結合領域周辺の配列同一性が低いため、糖アクセプターの認識と生成物の位置選択性の基盤がよくわかっていない。PaGT3は植物Phytolacca americana由来の糖転移酵素であり、様々なアクセプターをグリコシル化することができる。PaGT3の構造と機能の関係を説明するために、その結晶構造を決定した。他のUGTとの比較により、PaGT3には糖供与体と糖受容体の結合ポケットが存在することを確認した。その結果、疎水性アクセプター結合ポケットの周囲に長いループ領域が存在し、柔軟で広いアクセプター結合ポケットが形成されていることが、PaGT3の重要な特徴であることがわかった。本研究では、１８-クラウン-６エーテルまたは１５-クラウン-５エーテルとの共結晶により、ＰａＧＴ３の結晶を成長させた。その結果、不斉単位のクラウンエーテル分子が金属イオンと錯体を形成していることが確認され、その錯体は、タンパク質の2分子のGlu238の主鎖O原子によって2面に配位されていた。このクラウンエーテル-金属錯体は、PaGT3の2分子をくっつけて結晶成長を促進する分子接着剤のようなものである。このように、本成果は、糖転移酵素の研究において、PaGT3の基質認識戦略を明らかにするものである。さらに、クラウンエーテル-金属イオン複合体がタンパク質の結晶化のための分子接着剤として利用できることを示した。

Uridine diphosphate glycosyltransferases (UGTs) are ubiquitous enzymes that are involved in the glycosylation of small molecules. As glycosylation improves the water solubility and stability of hydrophobic compounds, interest in the use of UGTs for the synthesis of glycosides of poorly soluble compounds is increasing. While sugar-donor recognition in UGTs is conserved with the presence of a plant secondary product glycosyltransferase (PSPG) motif, the basis of the recognition of the sugar acceptor and the regioselectivity of the products is poorly understood owing to low sequence identity around the acceptor-binding region. PaGT3, a glycosyltransferase from the plant Phytolacca americana, can glycosylate a range of acceptors. To illustrate the structure-function relationship of PaGT3, its crystal structure was determined. The sugar-donor and sugar-acceptor binding pockets in PaGT3 were recognized by comparison of its structure with those of other UGTs. The key feature of PaGT3 was the presence of longer loop regions around the hydrophobic acceptor-binding pocket, which resulted in a flexible and wider acceptor binding pocket. In this study, PaGT3 crystals were grown by co-crystallization with 18-crown-6 ether or 15-crown-5 ether. The crown-ether molecule in the asymmetric unit was observed to form a complex with a metal ion, which was coordinated on two sides by the main-chain O atoms of Glu238 from two molecules of the protein. The crown ether-metal complex resembles a molecular glue that sticks two molecules of PaGT3 together to enhance crystal growth. Thus, this result provides an insight into the substrate-recognition strategy in PaGT3 for the study of glycosyltransferases. Additionally, it is shown that crown ether-metal ion complexes can be used as a molecular glue for the crystallization of proteins.