羊のマイコプラズマ性肺炎を迅速に検出するための等温リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法の開発と検証

Development and validation of the isothermal recombinase polymerase amplification assays for rapid detection of Mycoplasma ovipneumoniae in sheep.

• Jinfeng Wang
• Ruiwen Li
• Xiaoxia Sun
• Libing Liu
• Xuepiao Hao
• Jianchang Wang
• Wanzhe Yuan

抄録

背景:

マイコプラズマ肺炎は世界の羊やヤギの生産を脅かす重要な感染症であり，マイコプラズマ肺炎を引き起こす主要な病因の一つである．このような病原体の検出には、RPA（Recombinase polymerase Amplification）と呼ばれる等温核酸増幅法が用いられており、RPAを用いた診断法が報告されている。

BACKGROUND: Mycoplasmal pneumonia is an important infectious disease that threatens sheep and goat production worldwide, and Mycoplasma ovipneumoniae is one of major etiological agent causing mycoplasmal pneumonia. Recombinase polymerase amplification (RPA) is an isothermal nucleic acid amplification technique, and RPA-based diagnostic assays have been described for the detection of different types of pathogens.

結果:

16S rRNA遺伝子の保存領域を標的としたM. ovipneumoniaeを検出するために、リアルタイム蛍光検出（リアルタイムRPA）およびラテラルフローストリップ検出（LFS RPA）を用いたRPAアッセイを開発した。リアルタイムRPAはポータブル蛍光スキャナーを用いて39℃で20分間行った。LFS RPAは、ポータブルメタルバスインキュベーター中で39℃で15分間実施し、アンプリコンを5分以内にラテラルフローストリップ上で肉眼で可視化した。いずれのアッセイも、他の微生物、特に呼吸器複合体に関与する病原体や反芻動物で頻繁に同定される他のマイコプラズマとの交差反応がなかったため、M. ovipneumoniaeに対して非常に特異的であった。LFS RPAアッセイの検出限界は，標的遺伝子を鋳型とした組換えプラスミドを用いた場合，1反応あたり1.0×10コピーであり，リアルタイムRPAアッセイおよびリアルタイムPCRアッセイの検出限界の10倍以下であった。RPAアッセイは、臨床羊鼻腔スワブおよび新鮮な肺サンプル111検体でさらに検証され、リアルタイムRPAでは29検体、LFS RPAでは31検体、リアルタイムPCRアッセイでは32検体からM. ovipneumoniaeのDNAが検出されました。リアルタイムPCR法と比較して，リアルタイムRPAおよびLFS RPAは，診断特異度100および98.73％，診断感度90.63および93.75％，κ係数0.932および0.934を示した．

RESULTS: The RPA assays using real-time fluorescence detection (real-time RPA) and lateral flow strip detection (LFS RPA) were developed to detect M. ovipneumoniae targeting a conserved region of the 16S rRNA gene. Real-time RPA was performed in a portable florescence scanner at 39 °C for 20 min. LFS RPA was performed in a portable metal bath incubator at 39 °C for 15 min, and the amplicons were visualized with the naked eyes within 5 min on the lateral flow strip. Both assays were highly specific for M. ovipneumoniae, as there were no cross-reactions with other microorganisms tested, especially the pathogens involved in respiratory complex and other mycoplasmas frequently identified in ruminants. The limit of detection of LFS RPA assay was 1.0 × 10 copies per reaction using a recombinant plasmid containing target gene as template, which is 10 times lower than the limit of detection of the real-time RPA and real-time PCR assays. The RPA assays were further validated on 111 clinical sheep nasal swab and fresh lung samples, and M. ovipneumoniae DNA was detected in 29 samples in the real-time RPA, 31 samples in the LFS RPA and 32 samples in the real-time PCR assay. Compared to real-time PCR, the real-time RPA and LFS RPA showed diagnostic specificity of 100 and 98.73%, diagnostic sensitivity of 90.63 and 93.75%, and a kappa coefficient of 0.932 and 0.934, respectively.

結論:

開発されたリアルタイムRPAおよびLFS RPAアッセイは、特に資源が限られた環境下で、羊におけるM. ovipneumoniaeの迅速、便利で信頼性の高い検出のための魅力的で有望なツールを提供します。しかし、開発したRPA法のヤギにおけるM. ovipneumoniaeの検出における有効性については、さらなる検証が必要である。

CONCLUSIONS: The developed real-time RPA and LFS RPA assays provide the attractive and promising tools for rapid, convenient and reliable detection of M. ovipneumoniae in sheep, especially in resource-limited settings. However, the effectiveness of the developed RPA assays in the detection of M. ovipneumoniae in goats needs to be further validated.