酵素-基質-補因子の動的ネットワークを高分解能フィールドサイクルリラクソメトリーで解明

Enzyme-Substrate-Cofactor Dynamical Networks Revealed by High-Resolution Field Cycling Relaxometry.

• Masha M Rosenberg
• Tianjiong Yao
• Gregory C Patton
• Alfred G Redfield
• Mary F Roberts
• Lizbeth Hedstrom

抄録

酵素の触媒作用は、酵素、基質、補酵素の動的な配列に依存していますが、ダイナミクスの役割は、通常、タンパク質の観点からアプローチされてきました。私たちは、これまであまり知られていなかったNMR技術であるサブテスラ高分解能フィールドサイクリングP NMRリラクソメトリーを用いて、グアニシン-5'-一リン酸還元酵素(GMPR)における酵素結合基質と補因子のダイナミクスを調べてきました。GMPRは2つのデッドエンドを形成しているが、触媒的には有能であり、触媒サイクルの異なるステップを模倣した複合体を形成している。E-IMP-NADPは部分的な水素化物移動反応を行い、E-GMP-NADPは部分的な脱アミノ化反応を行います。それぞれの部分反応には異なる補酵素構造が必要である。ここでは、補酵素の構造とアンモニア結合を変化させるように設計された突然変異の効果を報告するとともに、水素化物移動と脱アミノ化複合体の特徴的な動的特徴を明らかにすることを目的としている。これらの実験から、Asp129は水素化物移動と脱アミノ化の両方に必要な動的ネットワークの中心的な歯車であることが示唆された。対照的に、Lys77は基質と補酵素のコンフォメーションと移動度を反応特異的な方法で調節している。Thr105とTyr318は、GMPの2'-OHを含む脱アミノ化特異的なダイナミックネットワークの一部である。これらの残基は、水素化物移動錯体の動的特性には比較的ほとんど影響を与えない。これらの結果は、リガンドのダイナミクスを調べるための高分解能フィールドサイクリックNMRリラクソメトリーの可能性をさらに示している。さらに、NH/NHは脱アミノ錯体には高い親和性を持つが、水素化物移動錯体には低い親和性を持つことを交換実験で明らかにし、アンモニアの移動が補酵素のコンフォメーション変化のゲートとなる可能性を示唆した。これらの実験から、酵素、基質、補酵素は複雑で反応特異的な動的ネットワークでつながっており、基質と補酵素の遠位部分がこれらのネットワークの重要な特徴であることが明らかになった。

The remarkable power and specificity of enzyme catalysis rely on the dynamic alignment of the enzyme, substrates, and cofactors, yet the role of dynamics has usually been approached from the perspective of the protein. We have been using an underappreciated NMR technique, subtesla high-resolution field cycling P NMR relaxometry, to investigate the dynamics of the enzyme-bound substrates and cofactor on guanosine-5'-monophosphate reductase (GMPR). GMPR forms two dead end, yet catalytically competent, complexes that mimic distinct steps in the catalytic cycle: E·IMP·NADP undergoes a partial hydride transfer reaction, while E·GMP·NADP undergoes a partial deamination reaction. A different cofactor conformation is required for each partial reaction. Here we report the effects of mutations designed to perturb cofactor conformation and ammonia binding with the goal of identifying the structural features that contribute to the distinct dynamic signatures of the hydride transfer and deamination complexes. These experiments suggest that Asp129 is a central cog in a dynamic network required for both hydride transfer and deamination. In contrast, Lys77 modulates the conformation and mobility of substrates and cofactors in a reaction-specific manner. Thr105 and Tyr318 are part of a deamination-specific dynamic network that includes the 2'-OH of GMP. These residues have comparatively little effect on the dynamic properties of the hydride transfer complex. These results further illustrate the potential of high-resolution field cycling NMR relaxometry for the investigation of ligand dynamics. In addition, exchange experiments indicate that NH/NH has a high affinity for the deamination complex but a low affinity for the hydride transfer complex, suggesting that the movement of ammonia may gate the cofactor conformational change. Collectively, these experiments reinforce the view that the enzyme, substrates, and cofactor are linked in intricate, reaction-specific, dynamic networks and demonstrate that distal portions of the substrates and cofactors are critical features in these networks.