減衰全反射フーリエ変換赤外（ATR-FTIR）分光法によるインタクトな細胞外小胞の無試薬全タンパク質定量

Reagent-free total protein quantification of intact extracellular vesicles by attenuated total reflection Fourier transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopy.

• Veronika Szentirmai
• András Wacha
• Csaba Németh
• Diána Kitka
• Anita Rácz
• Károly Héberger
• Judith Mihály
• Zoltán Varga

抄録

細胞外小胞(EV)は、細胞内で活発に合成・放出される脂質二重層結合粒子である。EVの主成分は脂質、タンパク質、核酸であり、その組成はその種類や由来に特徴があり、親細胞の生理的・病理的状態を明らかにする。また、EVの濃度やタンパク質組成はEVの機能と密接に関連しており、総タンパク質量の測定はEVをベースとした診断や疾患予後の診断に役立つと考えられている。ここでは、減弱全反射フーリエ変換赤外（ATR-FTIR）分光法に基づいたシンプルで試薬を使用しない方法を紹介し、さらにサンプルを前処理することなくEVサンプルのタンパク質含有量を定量する。ウシ血清アルブミンで校正した後、赤血球由来のEV（REV）のタンパク質濃度をATR-FTIR分光法で調べた。赤血球由来EVの赤外スペクトルからアミドIバンドの積分面積を算出したところ、二次構造にかかわらず、試料中のタンパク質量に比例していた。スパイクテストと希釈テストを行い、EVサンプルのタンパク質定量にATR-FTIR分光法を使用する能力を決定しました。さらに，ウシ血清アルブミンとEVのスペクトルについて，部分最小二乗法（PLS）回帰法による多変量校正を行った．R値は校正セットで0.94、検証セットで0.91であった。この結果は，ATR-FTIR 測定が EV の無試薬タンパク質定量に信頼性の高い方法を提供することを示している．グラフィカルアブストラクト。

Extracellular vesicles (EVs) are lipid bilayer-bounded particles that are actively synthesized and released by cells. The main components of EVs are lipids, proteins, and nucleic acids and their composition is characteristic to their type and origin, and it reveals the physiological and pathological conditions of the parent cells. The concentration and protein composition of EVs closely relate to their functions; therefore, total protein determination can assist in EV-based diagnostics and disease prognosis. Here, we present a simple, reagent-free method based on attenuated total reflection Fourier transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopy to quantify the protein content of EV samples without any further sample preparation. After calibration with bovine serum albumin, the protein concentration of red blood cell-derived EVs (REVs) were investigated by ATR-FTIR spectroscopy. The integrated area of the amide I band was calculated from the IR spectra of REVs, which was proportional to the protein quantity in the sample' regardless of its secondary structure. A spike test and a dilution test were performed to determine the ability to use ATR-FTIR spectroscopy for protein quantification in EV samples, which resulted in linearity with R values as high as 0.992 over the concentration range of 0.08 to 1 mg/mL. Additionally, multivariate calibration with the partial least squares (PLS) regression method was carried out on the bovine serum albumin and EV spectra. R values were 0.94 for the calibration and 0.91 for the validation set. The results indicate that ATR-FTIR measurements provide a reliable method for reagent-free protein quantification of EVs. Graphical abstract.