中国で流行している4種類の豚ウイルスに対する抗体を同時に検出するための新しいプロテインチップ

A novel protein chip for simultaneous detection of antibodies against four epidemic swine viruses in China.

• Yue Wu
• Xudan Wu
• Jing Chen
• Jingfei Hu
• Xiaobo Huang
• Bin Zhou

抄録

背景:

現在、中国の養豚業界は、複数の病原体による混合感染という複雑な状況に直面しています。それは同時に病原体または抗体を検出するためにいくつかの新しいハイスループット分子診断アッセイを開発することが急務である。バイオチップアレイ技術は、何千ものサンプルを同時にスクリーニングすることを可能にし、科学技術のブレークスルートップ10の1つに2度選ばれています。これまでに、鳥類感染性気管支炎ウイルスや反芻胃ブルートングウイルスに対する抗体検出にプロテインバイオチップを用いた有望な結果が報告されていますが、豚の病気の診断のためのこの技術の研究はまだほとんど行われていません。

BACKGROUND: At present, pig industry in China is faced with the complex situation of mixed infection caused by multiple pathogens. It is urgent to develop some new high-throughput molecular diagnosis assays to simultaneously detect pathogens or antibodies. Biochip array technology has made it possible to screen thousands of samples simultaneously; it has been twice named as one of the top 10 scientific and technological breakthroughs. Studies have reported encouraging results using protein biochips for detecting antibodies against avian infectious bronchitis virus and ruminant bluetongue virus, but the research of this technology for the diagnosis of swine diseases is still sparse.

結果:

本研究では、古典的な豚熱ウイルス（CSFV）、豚パルボウイルス（PPV）、日本脳炎ウイルス（JEV）、豚生殖呼吸器症候群ウイルス（PRRSV）の4種類の重要な豚ウイルスの抗体を同時に検出できる新規プロテインチップを開発した。CSFVの原核生物発現プラスミドpET-32a-E2、PPVの-VP2、JEVの-EDIII、PRRSVの-Nの4つの原核生物発現プラスミドをそれぞれIPTG（イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド）で誘導し、大腸菌で過剰発現させた。精製されたタンパク質はウェスタンブロッティングにより同定され、エポキシコーティングされたスライドガラスに印刷された。この診断チップの最適化されたパラメータは、E2、VP2、EDIII、Nタンパク質のスポット濃度が0.2、0.4、0.4mg/mLであることを示した。最適な一次抗体希釈率は1:50、二次抗体希釈率は1:600であった。市販のELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)キットと比較して、本チップの陽性・陰性の一致率は95.8%~100%、86.2%~100%であり、クロスリアクションも見られなかった。

RESULTS: In this study, a novel protein chip was developed that can simultaneously detect the antibodies of four important swine viruses as follow, classical swine fever virus (CSFV), porcine parvovirus (PPV), Japanese encephalitis virus (JEV), and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Four prokaryotic expression plasmids pET-32a-E2 of CSFV, -VP2 of PPV, -EDIII of JEV, and -N of PRRSV were induced by IPTG (Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside) and overexpressed in E.coli, respectively. The purified proteins were identified by Western blotting and then printed on epoxy-coated glass slides. The optimized parameters of this diagnostic chip showed that the spotting concentrations of E2、VP2、EDIII、N proteins were 0.2, 0.4, 0.4, and 0.4 mg/mL. The optimal primary and secondary antibody dilutions were 1:50 and 1: 600. Compared with the commercial ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) kits, the positive and negative coincidence rates of this chip were 95.8% ~ 100 and 86.2% ~ 100%, as well as, no cross-reaction.

結論:

このプロテインチップは、臨床血清中の抗体を同時に検出するための迅速、特異的、高感度な方法を提供します。従来の方法と比較して、このプロテインチップは非常に少量の血清をモニターすることができます。

CONCLUSION: This protein chip provided a fast, specific, and sensitive method for simultaneous detection of antibodies in clinical serum samples. Compared with traditional methods, this protein chip can monitor very small amount of serum.