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シームレスなゲノム編集を用いたヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入
Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells using Seamless Genome Editing.
PMID: 32449724 DOI: 10.3791/61152.
抄録
RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9のようなカスタムデザインのエンドヌクレアーゼは、哺乳類細胞における効率的なゲノム編集を可能にする。本研究では、ヒト多能性幹細胞を例に、肝細胞核因子4α(HNF4α)遺伝子座をシームレスにゲノム編集するための詳細な手順を記述する。ピギーバックベースのドナープラスミドとCRISPR-Cas9ニカーゼ変異体を組み合わせた2段階の遺伝子選択により、HNF4α遺伝子座の正確かつ効率的なターゲティングを実証した。
Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4α) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4α locus.