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乾燥血液スポット試料中のCYP21A2遺伝子の分子解析
Molecular analysis of the CYP21A2 gene in dried blood spot samples.
PMID: 32442933
抄録
先天性副腎過形成(CAH)は、コルチゾール生合成に関与する酵素の欠乏に起因する常染色体劣性疾患である。90％以上の症例では、CAHはCYP21A2遺伝子の欠失性突然変異に続発し、21-ヒドロキシラーゼ欠乏症（21OHD）を引き起こす。CYP21A2遺伝子は、第6染色体（6p21-3）の短腕に位置し、チトクロームP450C21酵素をコードしている。新生児スクリーニングプログラムは、乾燥血液スポット（DBS）中の17OH-プロゲステロンを定量するCAH-21OHDの古典的な形態を検出します。この検査は非常に感度が高いのですが、特異度が低く、結果を確認するために2回目のサンプルを必要とします。このような場合には、同じサンプルを用いた第二段階の検査が有用である。我々の目的は、DBSからのDNA抽出法を評価し、CYP21A2遺伝子変異の分子解析におけるそのようなDNAの性能を評価することであった。最初の新生児スクリーニングの結果からCAHを発症したと推定される12人の個体を、採血したばかりの血液から抽出したDNAを用いてEDTAとDBSで解析した。CYP21A2遺伝子は、全エクソンおよびイントロン境界の自動配列決定およびDBSでのMLPA解析により解析した。両抽出法による分子解析結果を比較した。本研究では、新生児スクリーニングDBSから抽出したDNAが、新生児スクリーニングプログラムの21-OHD診断確認におけるCYP21A2遺伝子変異を定義するのに有用なツールであり、その結果が従来のジェノタイピングと同等であることを示した。
Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is an autosomal recessive disorder due to a deficiency of enzymes involved in cortisol biosynthesis. In more than 90% of cases, CAH is secondary to deleterious mutations in the CYP21A2 gene leading to 21-hydroxilase deficiency (21OHD). The CYP21A2 gene is located on the short arm of chromosome 6 (6p21·3) and encodes the cytochrome P450C21 enzyme. Neonatal screening programs detect the classic forms of CAH-21OHD quantifying 17OH-progesterone in dried blood spots (DBS). This test is very sensitive, but it has a low specificity, requiring a second sample to confirm the result. In these cases, a second-tier test in the same sample may be useful. Our aim was to evaluate a DNA extraction method from DBS and assess the performance of such DNA in the molecular analysis of the CYP21A2 gene mutations. Twelve individuals, who presumably had CAH based on the initial neonatal screening results, were analyzed using DNA extracted from freshly collected blood on EDTA and DBS. The CYP21A2 gene was analyzed by automated sequencing of all exons and intron boundaries and MLPA analysis in DBS. Molecular analysis results from both extraction methods were compared. In this study, we show that DNA extracted from neonatal screening DBS is a useful tool to define CYP21A2 gene mutations in 21-OHD diagnostic confirmation for the newborn screening program and that its results are comparable to traditional genotyping.
喉頭上性肥大症（HSC）は、コルチゾールの生合成に関与するすべての酵素の欠乏によって引き起こされる自己染色体性の遺伝性疾患です。90％以上は、21ヒドロキシラサ（21OHD）を欠損するCYP21A2遺伝子の変異によるものです。この遺伝子は、encuentra enbra brazo corto del cromosoma 6 (6p21-3) y codifica para la enzima citocromo P450C21.Los programas de neonatal pesquisa programas detectan la forma clásica de la HSC-21OHD cuantificando 17OH-progesterona en gota de sangre en papel de filtro (GSPF)。このテストは非常に賢明ですが、結果を確認するために別のマウスを使用していることを考えると、特別なことはありません。このような場合には、他の測定値を使用することで結果を確認することができます。本研究の目的は、GSPFのサンプルにおけるADNの抽出方法とCYP21A2遺伝子の事後解析分子を評価することである。Analizamos doce individuos presumiblemente afectados por HSC en la pesquisa neonatal usando ADN extraído de sangre fresca recolectada sobre EDTA y de GSPF。GSPFのすべてのエクソンとMLPAの内部のすべてのエクソンと領域を自動解析してCYP21A2遺伝子の解析を実現し、結果を他の抽出方法と比較しています。本研究では、GSPFを用いたADNは、新生児期診断プログラムにおける21-OHDの確定診断におけるCYP21A2遺伝子の変異を解析するための有用な手法であり、その結果は従来の遺伝子操作性と比較可能であることを実証している。
La hiperplasia suprarrenal congénita (HSC) es un desorden autosómico recesivo producido por la deficiencia de alguna de las enzimas involucradas en la biosíntesis de cortisol. Más del 90% se debe a mutaciones en el gen CYP21A2 que genera deficiencia de 21 hidroxilasa (21OHD). Este gen se encuentra en el brazo corto del cromosoma 6 (6p21·3) y codifica para la enzima citocromo P450C21. Los programas de pesquisa neonatal detectan la forma clásica de la HSC-21OHD cuantificando 17OH-progesterona en gota de sangre en papel de filtro (GSPF). Este test es muy sensible, pero tiene baja especificidad , por lo que se utiliza una segunda muestra para confirmar el resultado. En estos casos, una segunda determinación en la misma muestra podría ser de utilidad. Nuestro objetivo fue evaluar el método de extracción de ADN y posterior análisis molecular del gen CYP21A2 en muestras de GSPF. Analizamos doce individuos presumiblemente afectados por HSC en la pesquisa neonatal usando ADN extraído de sangre fresca recolectada sobre EDTA y de GSPF. Realizamos el análisis del gen CYP21A2 mediante secuenciación automática de todos los exones y regiones intrónicas flanqueantes y MLPA en GSPF, y comparamos los resultados con ambos métodos de extracción. En este estudio demostramos que el ADN extraído de GSPF es una herramienta muy útil para analizar las mutaciones del gen CYP21A2 en la confirmación diagnóstica de 21-OHD para los programas de pesquisa neonatal y que los resultados son comparables con la genotipificación tradicional.