DNA複製タンパク質Cdc45は、Leishmania donovaniのPIPボックスを介してPCNAと直接相互作用し、Cdc45のPIPボックスは細胞の生存に不可欠である

DNA replication protein Cdc45 directly interacts with PCNA via its PIP box in Leishmania donovani and the Cdc45 PIP box is essential for cell survival.

• Aarti Yadav
• Varshni Sharma
• Jyoti Pal
• Pallavi Gulati
• Manisha Goel
• Udita Chandra
• Neha Bansal
• Swati Saha

抄録

DNA複製タンパク質Cdc45は、真核生物の複製ヘリカーゼの一部であり、他の構成要素はMcm2-7コアとGINSである。我々は、リーシュマニア・ドノヴァニCdc45のPIPボックスモチーフを同定した。このモチーフは、真核生物のクランプ増殖細胞核抗原（PCNA）との相互作用に関連している。ホモ三量体PCNAは、各モノマーに存在するループ領域を介して、最大3つの異なるタンパク質を同時に結合する可能性がある。複数の結合パートナーは、他の真核生物の複製機構の中から同定されており、これらのパートナーの協調的/連続的な結合は、複製プロセスの忠実性の中心となっています。リーシュマニア種とトリパノソーマ・クルジのCdc45には保存されているが、トリパノソーマ・ブルセイのCdc45にはPIPボックスが存在しない。ここでは、Cdc45とPCNAの相互作用の可能性と、そのような相互作用が生体内でどのような役割を果たしているのかを調べている。リーシュマニアのDNA複製におけるCdc45の重要性を確認した後、我々はCdc45とPCNAが全細胞抽出物中で安定的に相互作用し、インビトロでも直接相互作用することを確立した。この相互作用はCdc45のPIPボックスを介して媒介される。このPIPボックスは、リーシュマニアの生存に不可欠である。Cdc45 PIPボックスの重要性は、Schizosaccharomyces pombeにおいても検討されており、ここでも同様に細胞の生存に不可欠であることが判明した。我々の結果は、ライシュマニアのCdc45 PIPボックスがPCNAをクロマチン上にリクルートしたり、安定化させたりする役割を果たしていることを示唆している。Cdc45とPCNAの相互作用は、PCNAと関連する複製DNAポリメラーゼをDNAテンプレートに結びつけるのを助け、その結果、複製フォークの伸長を促進する可能性がある。PCNAに関連する複数の複製タンパク質は他の真核生物で確認されているが、Cdc45とPCNAの直接的な相互作用を示した最初の報告であり、我々の解析は、この相互作用がヒト細胞では発生しないことを示唆しているが、トリパノソーマイトイドに限定されないことを示唆している。

DNA replication protein Cdc45 is an integral part of the eukaryotic replicative helicase whose other components are the Mcm2-7 core, and GINS. We identified a PIP box motif in Leishmania donovani Cdc45. This motif is typically linked to interaction with the eukaryotic clamp proliferating cell nuclear antigen (PCNA). The homotrimeric PCNA can potentially bind upto three different proteins simultaneously via a loop region present in each monomer. Multiple binding partners have been identified from among the replication machinery in other eukaryotes, and the concerted /sequential binding of these partners are central to the fidelity of the replication process. Though conserved in Cdc45 across Leishmania species and Trypanosoma cruzi, the PIP box is absent in Trypanosoma brucei Cdc45. Here we investigate the possibility of Cdc45-PCNA interaction and the role of such an interaction in the in vivo context. Having confirmed the importance of Cdc45 in Leishmania DNA replication we establish that Cdc45 and PCNA interact stably in whole cell extracts, also interacting with each other directly in vitro. The interaction is mediated via the Cdc45 PIP box. This PIP box is essential for Leishmania survival. The importance of the Cdc45 PIP box is also examined in Schizosaccharomyces pombe, and it is found to be essential for cell survival here as well. Our results implicate a role for the Leishmania Cdc45 PIP box in recruiting or stabilizing PCNA on chromatin. The Cdc45-PCNA interaction might help tether PCNA and associated replicative DNA polymerase to the DNA template, thus facilitating replication fork elongation. Though multiple replication proteins that associate with PCNA have been identified in other eukaryotes, this is the first report demonstrating a direct interaction between Cdc45 and PCNA, and while our analysis suggests the interaction may not occur in human cells, it indicates that it may not be confined to trypanosomatids.