DNA配列、物理学、プロモーター機能。T7プロモーターのバリアント活性に関するハイスループットデータの解析

DNA sequence, physics, and promoter function: Analysis of high-throughput data On T7 promoter variants activity.

• Mikhail A Orlov
• Anatoly A Sorokin

抄録

RNAポリメラーゼ/プロモーター認識は、分子生物学の基本的な問題である。この分野では何十年にもわたって研究が進められてきましたが、いまだにいくつかの課題が残っています。そのためには、最適なモデル生物を用いることが重要である。T7バクテリオファージRNAポリメラーゼ/T7ネイティブプロモーターのシステムは、この目的のための例外的な例である。また、これまでに最も研究され、バイオテクノロジーやバイオエンジニアリングの目的に応用することに成功しています。その理由は、この分子デュオの構造の単純さと高い特異性にあります。異なるT7ネイティブプロモーターの非常に類似した配列にもかかわらず、T7 RNAポリメラーゼ酵素は、高度に特異的で調整可能な方法でそれぞれのプロモーターを結合することができます。ここでの一つの説明は、このプロセスがヌクレオチド配列ではなく、主にＤＮＡの物理的性質に依存していることである。ここでは、小村らが最近発表した膨大なデータを解析することでこの問題に取り組む。この最初の研究では、複数の置換を持つものを含むプロモーターバリアントの活性を定量化するために、次世代シークエンシング（NGS）を採用しました。その結果、一塩基の配列変化の同時発生には大きな偏りがあることがわかった。置換に関与するヌクレオチドの位置と種類（初期と結果の両方）を考慮すると、19b.p.の長さの配列全体では、NからAへの置換が最も好ましいことが容易にわかる。同時に、NからCへの置換は結合領域の認識ループの重要な位置でのみ許容され、NからGへの置換は一様に最も許容されないことがわかります。後に、この研究では、変異体の完全なセットを、(1)結合領域のみに変異があるグループ、(2)融解領域のみに変異があるグループ、(3)両方の領域に変異があるグループに分割した。これらの3つのグループのうち、第2は非常に少ない変異体（他の2つのグループよりも少ない3桁の割合で、46対1,6,000以上）で構成されています。しかし、これらは、高活性に実質的なすべてのプロモーターである。このグループ２は一次配列から見て異質であるように見えたが、実際、平均以上の活性を持つものと平均以下の活性を持つものにさらに細分化してみると、最初のグループは融解領域の２位に無視できるほどの保存性を持つプロモーターで構成されていることが判明した；２番目のグループはこの融解領域にはほとんど保存されていなかった。このことは、2ヌクレオチドがランダム化されたクラスIIIのT7プロモーターの完全なコンセンサス配列に我々の注意を引く（4つのすべての4つは、以前に発表されたソースのデータセットでは1から数コピーで存在している）、画像はさらに顕著になります。したがって、位置での突然変異は、プロモーター活性の点で有意な変化を引き起こさないことを示唆している。同時に、このような変異は、我々の研究で計算されたDNAの物理的性質（すなわち、静電ポテンシャルと曲がりやすさ）を劇的に変化させます。ここで考えられる一つの示唆は、2ヌクレオチドが一般的なスイッチとして機能している可能性があるということです；もしそうであれば、2Aから2Tへの置換は重要な制御的結果をもたらします。2b.p.がT7ゲノムのクラスII対クラスIIIプロモーターの間で最も明らかに異なるヌクレオチドであること、およびそれがまた、T7ゲノムのクラスIIIプロモーターと、相対的ではあるが生殖的に単離されたバクテリオファージT3のプロモーターとを区別することは、事実である。言い換えれば、2ヌクレオチドの変異はプロモーターの活性を阻害しないが、その物理的性質を変化させ、その結果、RNAポリメラーゼとプロモーターの相互作用に影響を与えることが可能であるように思われる。

RNA polymerase/promoter recognition represents a basic problem of molecular biology. Decades-long efforts were made in the area, and yet certain challenges persist. The usage of certain most suitable model subjects is pivotal for the research. System of T7 bacteriophage RNA-polymerase/T7 native promoter represents an exceptional example for the purpose. Moreover, it has been studied the most and successfully applied to aims of biotechnology and bioengineering. Both structural simplicity and high specificity of this molecular duo are the reason for this. Despite highly similar sequences of distinct T7 native promoters, the T7 RNA-polymerase enzyme is capable of binding respective promoter in a highly specific and adjustable manner. One explanation here is that the process relies primarily on DNA physical properties rather than nucleotide sequence. Here, we address the issue by analyzing massive data recently published by Komura and colleagues. This initial study employed Next Generation Sequencing (NGS) in order to quantify activity of promoter variants including ones with multiple substitutions. As a result of our work substantial bias in simultaneous occurrence of single-nucleotide sequence alterations was found: the highest rate of co-occurrence was evidenced within specificity loop of binding region while the lowest - in initiation region of promoter. If both location and a kind of nucleotides involved in replacement (both initial and resulting) are taken into consideration, one can easily note that N to A substitutions are most preferred ones across the whole 19 b.p.-long sequence. At the same time, N to C are tolerated only at crucial position in recognition loop of binding region, and N to G are uniformly least tolerable. Later in this work the complete set of variants was split into groups with mutations (1) exclusively in binding region; (2) exclusively in melting region; (3) in both regions. Among these three groups second comprises extremely few variants (at triple-digit rate lesser than in two other groups, 46 versus over one and six thousand). Yet these are all promoter with substantial to high activity. This group two appeared heterogenous by primary sequence; indeed, upon further subdivision into above versus below average activity subgroups first one was found to comprise promoters with negligible conservation at 2 position of melting region; the second was hardly conserved in this region at all. This draws our attention to perfect consensus sequence of class III T7 promoter with 2 nucleotide randomized (all four are present by one to several copies in the previously published source dataset), the picture becomes even more pronounced. We therefore suggest that mutations at the position therefore do not cause significant changes in terms of promoter activity. At the same time, such modifications dramatically change DNA physical properties which were calculated in our study (namely electrostatic potential and propensity to bend). One possible suggestion here is that 2 nucleotide might function as a generic switch; if so, substitution 2A to 2T has important regulatory consequences. The fact that that 2 b.p. is the most evidently different nucleotide between class II versus class III promoters of T7 genome and that it also distinguishes the class III promoter in T7 genome versus promoters of its relative but reproductively isolated bacteriophage T3. In other words, it appears feasible that mutation at 2 nucleotide does not impede promoter activity yet alter its physical properties thus affecting differential RNA polymerase/promoter interaction.