発表されたデータのバイオインフォマティクス的評価に基づく細菌リボソームプロファイリング実験の推奨事項

Recommendations for bacterial ribosome profiling experiments based on bioinformatic evaluation of published data.

• Alina Glaub
• Christopher Huptas
• Klaus Neuhaus
• Zachary Ardern

抄録

リボソームプロファイリング（RIBO-Seq）は、多くのアノテーションされていない遺伝子を発見するなど、細菌の翻訳に関する理解を向上させてきた。しかし、RIBO-Seqのプロトコルとそれに対応するデータ解析はまだ標準化されていない。ここでは、ライソジニーブロス培地で増殖させたK12の9つの研究から得られた48のRIBO-Seqサンプルを解析し、特にサイズ選択ステップに注目した。我々は、従来の発現解析では、タンパク質をコードする断片を得るためには、22から30ヌクレオチドの間のサイズ範囲で十分であり、これは多くの不要なrRNAおよびtRNAリードを除去できるという利点があることを示している。より特異的な解析を行うには、より長いリードが必要となり、それに対応してrRNA/tRNA枯渇の改善が必要となる場合がある。原核生物におけるRIBO-Seq実験の適切なシークエンス深度についてはコンセンサスが得られておらず、研究の総リード数も大きく異なっています。我々の解析では、翻訳アノテーションされた遺伝子をグローバルに検出するためには、rRNA/tRNAにマッピングされていない2,000万個のリードが必要であることが示唆された。また、翻訳開始部位に偏りが生じる薬剤誘発性リボソームストールの影響も強調している。その結果、翻訳開始部位でのリードの蓄積は、弱く発現している遺伝子の検出に特に有用であるかもしれない。異なる質問に適した方法が異なるため、「ワンサイズフィットの」リボソームプロファイリングデータセットを作成することはできないかもしれません。したがって、実験は興味のある科学的な質問に照らして慎重に設計されなければならない。我々は、新しいRIBO-Seqデータセットで報告すべきいくつかの基本的な特徴を提案する。議論された要因に注意深く注意を払うことは、原核生物の遺伝子検出とリボソームプロファイリングデータセットの比較可能性を向上させるはずである。

Ribosome profiling (RIBO-Seq) has improved our understanding of bacterial translation, including finding many unannotated genes. However, protocols for RIBO-Seq and corresponding data analysis are not yet standardized. Here, we analyzed 48 RIBO-Seq samples from nine studies of K12 grown in lysogeny broth medium and particularly focused on the size-selection step. We show that for conventional expression analysis, a size range between 22 and 30 nucleotides is sufficient to obtain protein-coding fragments, which has the advantage of removing many unwanted rRNA and tRNA reads. More specific analyses may require longer reads and a corresponding improvement in rRNA/tRNA depletion. There is no consensus about the appropriate sequencing depth for RIBO-Seq experiments in prokaryotes, and studies vary significantly in total read number. Our analysis suggests that 20 million reads that are not mapping to rRNA/tRNA are required for global detection of translated annotated genes. We also highlight the influence of drug-induced ribosome stalling, which causes bias at translation start sites. The resulting accumulation of reads at the start site may be especially useful for detecting weakly expressed genes. As different methods suit different questions, it may not be possible to produce a "one-size-fits-all" ribosome profiling data set. Therefore, experiments should be carefully designed in light of the scientific questions of interest. We propose some basic characteristics that should be reported with any new RIBO-Seq data sets. Careful attention to the factors discussed should improve prokaryotic gene detection and the comparability of ribosome profiling data sets.

© 2020 Glaub et al.