真菌フィターゼのゲノムスケールでの特性評価、およびβ-プロペラフィターゼとヒスチジン酸ホスファターゼの比較研究

Genome-Scale Characterization of Fungal Phytases and a Comparative Study Between Beta-Propeller Phytases and Histidine Acid Phosphatases.

• Roberta Corsino Ferreira
• Murillo Peterlini Tavares
• Túlio Morgan
• Yan da Silva Clevelares
• Marina Quádrio Raposo Branco Rodrigues
• Maria Catarina Megumi Kasuya
• Tiago Antônio de Oliveira Mendes
• Valéria Monteze Guimarães

抄録

本研究は、新たなフィターゼ産生菌の探索を目的としたものである。インシリコゲノム解析により、12種のフィターゼ産生菌を選択することができた。その結果、フィターゼ分解酵素のうち、エステラーゼ様、β-プロペラフィターゼ（βPP）、ホスホグリセリン酸ムターゼ様、ヒスチジン酸ホスファターゼ（HAP）ファミリーのフィターゼの4つのグループを遺伝子配列に基づいて同定することができた。HAPファミリーに属するフィターゼとβPPフィターゼをコードする予測遺伝子を解析し、これらの酵素のインシリコ特性を解析したところ、触媒活性の間に分岐があることが示された。その結果、真菌のβPPフィターゼは、上皮成長因子様ドメインを持つことから、分子量が大きく（約77kDa）、そのために、βPPフィターゼとの間に触媒活性の差が生じていることがわかった。また、シグナルペプチドを含むフィターゼの配列は12個あり、そのうち7個はHAP、5個はβPPフィターゼに分類され、10個は非古典的な経路で分泌されるフィターゼと予測された。これらの真菌を液体または半固体培地で生育させ、真菌酵素抽出物を50℃および2.0から9.0の範囲のpHでフィチン酸ナトリウムを加水分解する能力について評価した。酵素アッセイ条件下でのリン酸塩放出量から、7種の真菌がフィターゼ生産者として同定された。また、実験的な酵素活性を組み合わせたin silico解析の結果、一部の菌がβPPフィターゼとHAPフィターゼを分泌することが示唆された。

This work intended to prospect new phytase-producing organisms. In silico genomic analyses allowed the selection of twelve potential phytase-producing fungi. Based on gene sequence, it was possible to identify four well-defined groups of phytate-degrading enzymes: esterase-like, β-propeller phytases (βPP), phosphoglycerate mutase-like, and phytases of the histidine acid phosphatases (HAP) family. Analysis of the predicted genes encoding phytases belonging to the HAP family and βPP phytases and in silico characterization of these enzymes indicated divergence among the catalytic activities. Predicted fungal βPP phytases exhibited higher molecular mass (around 77 kDa) probably due to the epidermal growth factor-like domain. Twelve sequences of phytases contained signal peptides, of which seven were classified as HAP and five as βPP phytases, while ten sequences were predicted as phytases secreted by non-classical pathways. These fungi were grown in liquid or semi-solid medium, and the fungal enzymatic extracts were evaluated for their ability to hydrolyze sodium phytate at 50 °C and pH ranging from 2.0 to 9.0. Seven fungi were identified as phytase producers based on phosphate release under enzyme assay conditions. Results obtained from in silico analyses combining experimental enzymatic activities suggest that some selected fungi could secrete βPP phytases and HAP phytases.