MNGIEの新規治療法としての培養網状細胞におけるチミジンホスホリラーゼの発現と保持

Expression and Retention of Thymidine Phosphorylase in Cultured Reticulocytes as a Novel Treatment for MNGIE.

• Marjolein Meinders
• Debbie Shoemark
• Johannes G G Dobbe
• Geert J Streekstra
• Jan Frayne
• Ashley M Toye

抄録

ミトコンドリア神経消化管脳筋症（MNGIE）は、チミジンホスホリラーゼ（TP）欠損症によって引き起こされるまれな常染色体代謝障害である。この疾患に対する治療介入の成功は、チミジンホスホリラーゼの効率的かつ長期的な循環のための手段に依存している。本研究では、造血幹細胞と赤血球細胞株（BEL-A）のレンチウイルス導入を利用して、活性TPを含む網状細胞を作製した。赤血球分化の間に過剰発現したTPの有意な損失は、ユビキチン化阻害剤MG132の添加によって減少させることができる。しかし、ヒトTPではユビキチン化部位が基質結合部位に位置しており、その除去により酵素活性が低下していた。TP の構造とメカニズムを検討した結果、これらの部位は基質が存在しない場合にのみ露出していることが示唆された。また、分化期に培地にチミジンを補給すると酵素分解が減少し、網状細胞に保持される TP の量が 2 倍になることを示した。この研究は、TPを発現する治療用の網状細胞を生成することができ、赤血球分化後の網状細胞におけるヒトTPの保持を確実にするためにユビキチン化部位をマスキングすることによってユビキチン媒介の分解を無効化することができることを原理的に証明するものである。

Mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy (MNGIE) is a rare autosomal metabolic disorder caused by thymidine phosphorylase (TP) deficiency. Successful therapeutic interventions for this disease rely on a means for efficient and long-lasting circulation of the TP enzyme. In this study we exploit lentiviral transduction of hematopoietic stem cells and an erythroid cell line (BEL-A) to generate reticulocytes that contain active TP. Significant loss of overexpressed TP during erythroid differentiation can be reduced by addition of the ubiquitination inhibitor MG132. However, the ubiquitination sites are located in the substrate binding site in human TP, and their removal abolished enzyme activity. Examination of the TP structure and mechanism suggested that these sites are only exposed in the absence of substrate. We show that supplementation of culture media with thymidine during differentiation reduces enzyme degradation, doubling the amount of TP retained in reticulocytes. This study provides proof of principle that therapeutic reticulocytes expressing TP can be generated and that ubiquitin-mediated degradation can be subverted through masking ubiquitination sites to ensure retention of human TP in reticulocytes following erythroid differentiation.

© 2020 The Authors.