局所接着キナーゼとSrcはフィブリノーゲン-γC-末端断片による微小血管の過疎化を媒介している

Focal adhesion kinase and Src mediate microvascular hyperpermeability caused by fibrinogen- γC- terminal fragments.

• Xiaohua Guo
• Rebecca A Eitnier
• Richard S Beard
• Jamie E Meegan
• Xiaoyuan Yang
• Alexandra M Aponte
• Fang Wang
• Peter R Nelson
• Mack H Wu

抄録

目的:

これまでに、フィブリノーゲン-γ鎖C末端産物（γC）による微小血管リークがRhoA依存性のメカニズムを介して発生することを報告してきた。本研究の目的は、γCが内皮の過疎化を誘導するシグナル伝達機構をさらに解明することであった。γCはチロシンキナーゼであるFAKとSrcを介した細胞内シグナル伝達に関与する膜貫通型インテグリン受容体である内皮αvβ3と結合し活性化することが知られていることから、γCがFAK-Src経路を活性化することで内皮バリア機能を変化させ、接合部の解離とRhoAを介した細胞骨格ストレス線維形成を引き起こすのではないかという仮説を立てた。

OBJECTIVES: We previously reported microvascular leakage resulting from fibrinogen-γ chain C-terminal products (γC) occurred via a RhoA-dependent mechanism. The objective of this study was to further elucidate the signaling mechanism by which γC induces endothelial hyperpermeability. Since it is known that γC binds and activates endothelial αvβ3, a transmembrane integrin receptor involved in intracellular signaling mediated by the tyrosine kinases FAK and Src, we hypothesized that γC alters endothelial barrier function by activating the FAK-Src pathway leading to junction dissociation and RhoA driven cytoskeletal stress-fiber formation.

方法と結果:

ラット腸間膜微小血管の生体内顕微鏡を用いて、γC投与による血漿蛋白質(アルブミン)の滲出量の増加を明らかにした。また、毛細管液濾過係数(Kfc)は、γCによる肺血管透過性の上昇を示した。さらに、γCは、培養ラット肺微小血管内皮細胞(RLMVEC)において、時間依存的及び用量依存的に内皮バリア抵抗性を低下させ、ウエスタンブロットによるFAK/Srcリン酸化検出の増加を伴った。FAKを薬理学的に阻害したり、遺伝子をサイレンシングしたりした実験では、γCによって誘発された微小血管のアルブミンや液漏れ、ストレス線維形成、VE-カドヘリンチロシンリン酸化が有意に減少し、γCによって誘発された内皮バリア機能障害が改善されたことが示された。Srcを標的とした場合も同様の結果が得られたが、FAKを阻害することでSrcの活性化が抑制され、γC介在性亢進におけるSrcの上流にFAKが存在することが示唆された。また、γCによる細胞骨格ストレス線維形成は、これらのチロシンキナーゼを阻害またはサイレンシングすることで、RhoA阻害と同時に減少した。

METHODS AND RESULTS: Using intravital microscopy of rat mesenteric microvessels, we show increased extravasation of plasma protein (albumin) resulting from γC administration. In addition, capillary fluid filtration coefficient (Kfc) indicated γC-induced elevated lung vascular permeability. Furthermore, γC decreased transendothelial barrier resistance in a time-dependent and dose-related fashion in cultured rat lung microvascular endothelial cells (RLMVECs), accompanied by increased FAK/Src phosphorylation detection by western blot. Experiments with pharmacological inhibition or gene silencing of FAK showed significantly reduced γC-induced albumin and fluid leakage across microvessels, stress-fiber formation, VE-cadherin tyrosine phosphorylation, and improved γC-induced endothelial barrier dysfunction, indicating the involvement of FAK in γC mediated hyperpermeability. Comparable results were found when Src was targeted in a similar manner, however inhibition of FAK prevented Src activation, suggesting that FAK is upstream of Src in γC-mediated hyperpermeability. In addition, γC-induced cytoskeletal stress-fiber formation was attenuated during inhibition or silencing of these tyrosine kinases, concomitantly with RhoA inhibition.

結論:

FAK-Src経路は、RhoAやストレス線維形成に関与する形で、γC誘発性の微小血管バリア機能障害、ジャンクションタンパクのリン酸化や組織化に寄与している。

CONCLUSION: The FAK-Src pathway contributes to γC-induced microvascular barrier dysfunction, junction protein phosphorylation and disorganization in a manner that involves RhoA and stress-fiber formation.