適応的実験室進化とオミックス技術を用いたサビネン耐性の向上

Improvement of sabinene tolerance of using adaptive laboratory evolution and omics technologies.

• Tong Wu
• Jinfeng Liu
• Meijie Li
• Ge Zhang
• Lijuan Liu
• Xing Li
• Xiao Men
• Mo Xian
• Haibo Zhang

抄録

背景:

二環式モノテルペンであるサビネンの生合成は、異種経路を導入し、再生可能な糖を炭素源として利用することで、人工微生物を用いて達成されてきた。しかし、この方法の効率と力価は、サビネンに対する宿主耐性が低い（真核生物と原核生物の両方で）ために制限されています。

Background: Biosynthesis of sabinene, a bicyclic monoterpene, has been accomplished in engineered microorganisms by introducing heterologous pathways and using renewable sugar as a carbon source. However, the efficiency and titers of this method are limited by the low host tolerance to sabinene (in both eukaryotes and prokaryotes).

結果:

本研究では、BL21(DE3)を実験室適応進化のための菌株として選定した。サビネン濃度を徐々に増加させた培地で連続的に継代して進化させたところ、サビネンに対して有意な耐性を示す進化株XYF(DE3)が得られた。その後、XYF(DE3)をサビネン産生の宿主としたところ、親株であるBL21(DE3)と比較して8.43倍の191.76mg/Lのサビネン産生を達成した。全ゲノム再配列により、XYF(DE3)株は超変異株であることが示唆された。サビネン耐性向上のメカニズムを明らかにするために、XYF(DE3)株とBL21(DE3)株のトランスクリプトームを比較解析したところ、アップレギュレーション遺伝子が734個、ダウンレギュレーション遺伝子が857個同定された。さらに、同定された遺伝子のサビネン耐性における役割をリバースエンジニアリングにより検証した。その結果、DLP12ファミリー遺伝子、内膜タンパク質遺伝子、メチルマロニル-CoAムターゼ遺伝子を過剰発現させることで、BL21(DE3)のサビネン耐性がそれぞれ127.7%、71.1%、75.4%増加することが明らかになった。さらに、走査型電子顕微鏡を用いて細胞の形態を観察した。その結果、サビネンストレス下では、親のBL21(DE3)は細胞長が増加したが、XYF(DE3)は正常な細胞形態を示した。また、BL21(DE3)では、サビネンストレス下では、XYF(DE3)を過剰発現させることで、サビネン産生を増加させることができた。

Results: In this study, BL21(DE3) was selected as the strain for adaptive laboratory evolution. The strain was evolved by serial passaging in the medium supplemented with gradually increasing concentration of sabinene, and the evolved strain XYF(DE3), which exhibited significant tolerance to sabinene, was obtained. Then, XYF(DE3) was used as the host for sabinene production and an 8.43-fold higher sabinene production was achieved compared with the parental BL21(DE3), reaching 191.76 mg/L. Whole genomes resequencing suggested the XYF(DE3) strain is a hypermutator. A comparative analysis of transcriptomes of XYF(DE3) and BL21(DE3) was carried out to reveal the mechanism underlying the improvement of sabinene tolerance, and 734 up-regulated genes and 857 down-regulated genes were identified. We further tested the roles of the identified genes in sabinene tolerance via reverse engineering. The results demonstrated that overexpressions of gene of the DLP12 family, the inner membrane protein gene , and the methylmalonyl-CoA mutase gene could increase sabinene tolerance of BL21(DE3) by 127.7%, 71.1%, and 75.4%, respectively. Furthermore, scanning electron microscopy was applied to monitor cell morphology. Under sabinene stress, the parental BL21(DE3) showed increased cell length, whereas XYF(DE3) showed normal cell morphology. In addition, overexpression of , or could partially rescue cell morphology under sabinene stress and overexpression of or could increase sabinene production in BL21(DE3).

結論:

本研究では、微生物によるサビネン生産のためのサビネン耐性菌株を得ただけでなく、サビネン耐性に重要な潜在的な制御機構を明らかにした。また、BL21(DE3)では、テルペン耐性に重要な因子であることが初めて確認された。

Conclusions: This study not only obtained a sabinene-tolerant strain for microbial production of sabinene but also revealed potential regulatory mechanisms that are important for sabinene tolerance. In addition, for the first time, , and were identified to be important for terpene tolerance in BL21(DE3).

© The Author(s) 2020.